轉iaaM高衣分棉花種質IF1-1雜種優勢分析及育種應用

劉存敬，江振興，張建宏，唐麗媛，張素君，田海燕，李興河，師樹新，崔瑞敏，張香云*

（1.河北省農林科學院棉花研究所，農業部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，河北　石家莊　050051；2.河北行政學院，河北　石家莊　050031）

轉iaaM高衣分棉花種質IF1-1雜種優勢分析及育種應用

劉存敬1，江振興2，張建宏1，唐麗媛1，張素君1，田海燕1，李興河1，師樹新1，崔瑞敏1，張香云1*

（1.河北省農林科學院棉花研究所，農業部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，河北石家莊050051；2.河北行政學院，河北石家莊050031）

轉iaaM（色氨酸單加氧酶基因）高衣分棉花種質已經培育出來，但應用于育種研究較少。我們利用轉iaaM高衣分棉花種質IF1-1做父本、16個陸地棉品種（系）做母本，分別配制雜交組合，檢測了親本及其F1和F2群體的iaaM遺傳；田間調查了材料的抗病性及農藝性狀，室內考查了產量構成因子，同時進行了產量統計分析；通過系統選育結合分子輔助選擇對雜交后代進行定向培育，獲得了新的高衣分種質，實現了該種質的育種應用。結果表明：（1）FBP7-iaaM是1對顯性基因；（2）與高衣分親本IF1-1相比，F1和F2代衣分不具備超中與超親優勢，但與16個母本品種（系）相比，卻能明顯提高現有品種（系）的衣分率；（3）F1代產量尤其是皮棉產量具備較明顯的超親優勢，皮棉產量優勢值為13.4%，這就意味著可以選擇生產上產量較高的品種與IF1-1配制雜交組合，選擇高優勢雜交種直接利用；（4）F1和F2代抗病性明顯好于IF1-1，但與母本相比較差，所以，在雜交后代的選擇中應注意觀察枯萎病和黃萎病的發病情況，選擇抗病性好的后代；（5）子棉產量的提高主要是通過鈴重和單株鈴數的增加來實現，皮棉產量的增加則是通過子棉產量與衣分的共同提高來完成；（6）雜交后代具備選擇出高衣分新品系的潛力。本研究實現了將國家科技重大專項獲得的第2代轉基因棉花種質應用于棉花育種，對提升我國生物育種水平具有重大意義。

IaaM（色氨酸單加氧酶）基因；IF-1種質系；雜種優勢；育種應用

我國是棉紡織品消費和出口大國，棉花生產在我國國民經濟中占有重要地位。利用傳統的育種方法曾在棉花品種改良上取得了很大成功，但是近20 a來，世界棉花品種的產量水平達到了一個平臺期。因此有人認為，利用現有的遺傳資源和育種手段難以再大幅度提高棉花產量［1］。生長素（auxin）是最早被發現的植物激素，其參與植物生長和發育的許多過程，如根和莖的發育與生長、器官衰老、維管束組織的形成與分化發育、頂端優勢以及植物的向性生長等。吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）是英國科學家Darwin父子在金絲雀虉草胚芽鞘向光性試驗中首先發現的生長素，現已證實其存在于高等植物以及細菌、真菌和藻類中。植物體內的生長素類物質以IAA為主，還有苯乙酸、吲哚丁酸和4-氯吲哚乙酸等。IaaM（色氨酸單加氧酶基因）是細菌中IAA合成途徑之一——吲哚乙酰胺途徑的關鍵酶基因，利用其轉化植物的基因工程研究和應用在國外已經開展多年，在國內也有少量報道［2］。植物激素對植物的生長、發育、分化和衰老過程均起著重要的調節作用，因此，對棉纖維細胞的分化和發育也不例外。關于激素對棉纖維發育的研究表明，IAA和赤霉素（GA3）對棉纖維的分化起著重要作用［3～9］，在棉纖維發育過程中IAA和GA3誘導纖維的發生與伸長［8，9］。西南大學將iaaM導入到棉花品種冀棉14中，育成了轉基因棉花新種質IF1-1［10］。該種質是通過對棉花內源生長素進行適量上調而顯著增加單位面積種皮的纖維細胞凸起數目來實現明顯提高其衣分并且降低纖維細度的目的，已被列為棉花第2代轉基因新種質材料。2012年3月河北省農林科學院棉花研究所從西南大學引進轉基因棉花種質新材料IF1-1，用于育種材料的創制和品種選育。

本研究旨為比較完整地鑒定IF1-1新材料在河北省種植時的產量、抗病性、纖維品質及其他重要性狀；獲得iaaM在棉花世代中的傳遞規律；直接利用該種質配制雜交組合的雜種優勢分析；篩選雜種后續世代，獲得新的轉基因高衣分種質。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選取17個不同類型的親本用于配制雜交組合，其中，父本為轉iaaM高衣分棉花種質新材料IF1-1（表1），由西南大學生物技術中心裴炎教授提供；母本有16個品種（系），分屬4個類型，分別是抗病材料1467系、4077系和優選3，優質材料N71、1498系和04N4，適機采材料N327、8120系和08-4系，高產材料2011SA4、冀豐919、創優棉9號、冀棉958、NJ5、2011QCA3號和中植棉2號，均由河北省農林科學院棉花研究所分子設計育種研究室提供。試驗材料為父本、16個母本及其配制的16個雜交組合的F1和F2植株，以及其后連續自交得到的雜交F3、F4和F5代。

1.2試驗方法

2012年河北省農林科學院棉花研究所自西南大學引進轉FBP7-iaaM基因高衣分棉花新種質IF1-1，以其為父本，以16個不同類型（高產、優質、抗病、適機采）的轉基因抗蟲棉花品種（系）為母本，在河北省農林科學院棉花研究所小安舍實驗站配制雜交組合16個；同年冬，將親本及F1代進行南繁。2013年在河北省農林科學院棉花研究所小安舍試驗站進行田間種植，其中，親本及F1代種植2行/區，F2代群體種植8行/區，不設重復，行距0.8 m，行長8.3 m，株距0.28 m，密度4.5萬株/hm2。

采用石磊巖等［11］的5級制，在6月20日枯萎病發病高峰期和8月20日黃萎病發病高峰期進行病株分級調查，計算親本、F1代、F2代的枯萎病和黃萎病病指（%），以病指數值確定品種的抗病類型。9月10日，調查棉花的株高、果枝節位、果枝數、單株鈴數等農藝性狀。收獲期，小區實收計產（kg/hm2），室內考察單鈴重（g）和衣分（%）等。根據公式，計算超中優勢和超親優勢：

表1　轉FBP7-iaaM高衣分材料IF1-1的外源基因Table 1　The exogenous gene of FBP-iaaM transgenic cotton line IF1-1 with high lint percentage

超中優勢（%）=（F-MP）/MP×100〔其中，MP=（P1+P2）/2〕

超親優勢（%）=（F-HP）/HP×100

式中，F、P1、P2分別為雜種、母本和父本性狀的平均值，MP為2個親本性狀的平均值，HP為高值親本性狀的平均值。

采用組織化學鑒定法，鑒定親本以及F1和F2代中的目的基因。參照Jefferson［12］的方法，配置GUS染色液。取幼苗真葉，放入96孔PCR板并置于冰上，加入GUS染色液25 μL/孔，37℃溫育4～6 h，統計出現藍色反應（GUS陽性）和無顯色反應（GUS陰性）的幼苗株數。

2014～2015年在河北省農林科學院棉花研究所小安舍試驗站種植F3和F4代材料進行田間鑒定，2行/區，不設重復，行距0.8 m，行長8.3 m，株距0.28 m，密度4.5萬株/hm2。采用組織化學鑒定法，鑒定參試材料中的目的基因。

利用Excel和SPSS 19.0軟件，進行數據的統計與分析。

2　結果與分析

2.1親本及雜交后代的田間表現

田間調查結果（表2和3）顯示，父本（IF1-1）生育期121 d左右；植株塔型，較矮；葉片中等大小、綠色，茸毛較少；鈴卵圓型；果枝節位較低，果枝數較少，單株鈴數和霜前花率中等，鈴重小，衣分高，產量低；在河北省農林科學院棉花研究所小安舍實驗站枯黃萎病圃進行抗病性鑒定，其枯萎病指為87.4、黃萎病指為36.2，高感枯萎病和黃萎病。與父本相比，16個母本普遍表現植株較高，果枝節位較高，果枝數較多，鈴重大，衣分低，產量高，抗病性好；16個雜交組合的F1和F2代均表現正常。

2.2FBP7-iaaM的基因遺傳分析

鑒定結果（表4）顯示，父本IF1-1全部表現藍色，為轉FBP7-iaaM高衣分品系；16個母本全部表現為不變色，為非轉FBP7-iaaM品種（系）；F1代全部表現藍色，F2代中變藍株數與不變藍株數的比例基本符合3∶1的分離比例。表明IF1-1種質的高衣分性狀是由1對顯性基因控制的質量性狀，即：FBP7-iaaM為顯性基因。

表2　親本、F1代、F2代產量性狀和產量的平均值與變化范圍Table 2　Mean value and variation range of the yield and yield traits from parents，F1and F2

表3　親本、F1代、F2代抗病性和農藝性狀的平均值與變化范圍Table 3　Mean value and variation range of the disease resistance and agronomic traits from parents，F1and F2

表4　親本、F1代和F2代的組織化學鑒定結果Table 4　Tissue chemistry identification results for the parents，F1and F2

2.3F1代和F2代的雜種優勢分析

雜種優勢分析結果（表5）顯示，與高衣分親本IF1-1相比，F1和F2代衣分均不具備超中和超親優勢，但與母本相比卻具有明顯優勢，分別較母本平均衣分高3.0%和2.4%；F1代單鈴重具備明顯的超中優勢（16.1%）和超親優勢（4.0%），F2代單鈴重具備明顯的超中優勢（12.7%）但不具備超親優勢（-6.4%）；F1代霜前花率具備負的超中和超親優勢（優勢值分別為-4.5%和-5.1%），F2代具備負的超中優勢（-5.9%）和較小的超親優勢（1.1%）；F1和F2代子棉和皮棉產量均具備非常明顯的超中優勢（F1代優勢值分別為65.4%和 72.8%，F2代優勢值分別達到 43.3%和47.1%），且F1代2個性狀也具備超親優勢（優勢值分別為7.0%和13.4%），但F2代不具備超親優勢（優勢值分別為-7.2%和-3.3%）；F1和F2代枯萎病指和黃萎病指均具備明顯的負超中優勢（F1代優勢值分別為-43.2%和-27.7%，F2代優勢值分別為-29.0%和-11.6%），其中，F1代2個性狀超親優勢（優勢值分別為102.8%和91.2%）明顯，而F2代超親優勢（優勢值分別高達160.9%和158.1%）更加明顯；株高與果枝數的優勢變化規律相同，F1和F2代2個性狀均具有明顯的超中優勢（株高優勢值分別為19.3%和18.6%，果枝數優勢值分別為11.1%和7.6%），但均不具備超親優勢（株高優勢值分別為-1.6%和-2.1%，果枝數優勢值分別為-2.5%和-5.4%）；F1代單株鈴數的超中優勢（9.0%）和超親優勢（7.3%）均表現為正，而F2代均表現為負（優勢值分別為-3.3%和-4.3%）；F1代第一果枝節位超中優勢（4.5%）為正、超親優勢（-7.5%）為負，F2代超中優勢（-2.5%）和超親優勢（-13.6%）均為負值。

表5　F1代和F2代的雜交優勢Table 5　Heterosis analysis for F1and F2of hybrid combination

綜上分析可以看出，（1）雖然與高衣分親本IF1-1相比，F1和F2代衣分不具備超中與超親優勢，但與16個母本品種（系）相比，卻能明顯提高現有品種（系）的衣分率；（2）F1代產量尤其是皮棉產量具備較明顯的超親優勢，皮棉產量優勢值為13.4%，這就意味著可以選擇生產上產量較高的品種與IF1-1配制雜交組合，選擇高優勢雜交種直接利用；（3）F1和F2代的抗病性均明顯好于IF1-1，但與母本相比較差，所以，在雜交后代的選擇中，要注意觀察枯萎病和黃萎病的發病情況，選擇抗病性好的后代；（4）子棉產量的提高主要通過鈴重和單株鈴數的增加來實現，皮棉產量的增加則是通過子棉產量與衣分的共同提高來完成。

2.4雜交后代的選擇與應用

2014年篩選，2015年種植，混合法雜交后代3代材料（16份，6001～6014區和6030～6031區）的衣分變異幅度為40.1%～46.4%、鈴重為5.7～8.8 g，4代材料（15份，6015～6029區）的衣分變異幅度為34.7%～44.6%、鈴重為5.6～7.1 g；分子標記法（GUS檢測單株）4代材料（17份，6032～6048區）的衣分變異幅度為42.7%～52.3%、鈴重為5.3～7.0 g，未GUS檢測單株3代材料（22份，6056～6077區）的衣分變異幅度為35.3%～49.8%；系譜法4代單株材料（29份，6078～6106區）的衣分變異幅度為36.4%～49.1%，5代單株材料（22份，6166～6187區）的衣分變異幅度為37.7%～47.6%。由親本材料選出3個單株，其中，6112衣分為48.4%，6114衣分為51.8%。

3　結論與討論

關于IF1-1的報道雖然較多［10，13～15］，但多為國家科技報告和學位論文中應用，且以基礎研究為主。而本研究是以該種質的育種應用為目的，研究了該種質的雜種優勢利用與后代選擇。

雜交種在產量及產量構成因素方面，霜前皮棉產量具有顯著的雜種優勢，霜前子棉產量次之；衣分、鈴重和株高具有明顯的雜種優勢，單株果枝數次之，子指不具優勢，單株結鈴數具有負優勢［16］。郝俊杰［17］通過比較9個親本品種的產量和產量組成因素、一般配合力和品種雜種優勢的效應值，發現中棉所41、邯鄲109、魯研棉28是雜種優勢利用中比較好的親本，F1代的大多數性狀表現群體平均優勢，但群體超親優勢的比例偏低。本研究中，與IF1-1配制的雜交組合皮棉產量具備較明顯的超親優勢，表明雖然轉iaaM高衣分棉花種質IF1-1本身缺點較多，但作為親本材料仍然是雜種優勢利用中比較好的親本。在棉花雜交育種后代群體中，個體間衣分變化呈正態分布，超低衣分和超高衣分個體出現的幾率不多［18］，但并非不能，本研究獲得了超高衣分育種材料。

雖然利用轉基因技術可以實現棉花種質的突破，但是利用這些種質培育出突破性的棉花品種卻離不開現有的育種技術［19～21］。

［1］Meredith W R.Cotton yield progress why has it reached a plateau？［J］.Better Crops，2000，84：6-9.

［2］劉迪，李群，李冠.IAA合成關鍵基因iaaM研究進展［J］.生物技術，2008，18（2）：87-90.

［3］Ramsey J C，Berlin J D.Ultrastructural aspects of early stages in cotton fiber elongation［J］.American Journal of Botany，1976，63（6）：868-876.

［4］Beasley C A，Ting I P.The effects of plant growth substances on in vitro fiber development from fertilized cotton ovules［J］.American Journal of Botany，1973，60（2）：130-139.

［5］ Beasley C A.In vitro culture of fertilized cotton ovules［J］.Bioscience，1971，21（17）：906-907.

［6］Gokani S J，Kumar R，Thaker V S.Potential role of abscisic acid in cotton fiber and ovule development［J］. Journal of Plant Growth Regulation，1998，17（1）：1-5.

［7］陳德華，成廣明，周桂生.高產棉花整株鈴重的提高與棉鈴內源激素GA及ZR的關系［J］.揚州大學學報，2002，23（1）：68-71.

［8］程超華，王學德，姚艷玲.生長素和赤霉素對棉花短纖維突變體纖維長度的離體誘導作用 ［J］.作物學報，2005，31（2）：229-233.

［9］杜雄明，孫君靈，周忠麗，潘照娥，龐保印.棉花胚珠和葉片激素含量與纖維性狀的相關分析［J］.西北植物學報，2004，24（12）：2296-2302.

［10］裴炎.高衣分轉基因棉花IF1-1的環境釋放［R］.國家科技報告，2013.

［11］石磊巖，王波，文學.我國棉花黃萎病菌類型分化及培養特性研究［J］.植物保護學報，1993，20（3）：247-251.

［12］ Jefferson RA.Assaying chimeric genes in plants：The GUS gene fusion system［J］.Plant Mol Biol，1987，5（4）：387-405.

［13］裴炎，張桂寅.高衣分、優良馬克隆值轉基因棉花新品種（系）的轉育［R］.國家科技報告，2013.

［14］劉天雄.轉iaaM基因棉花纖維起始與發育的生物特性研究［D］.杭州：浙江大學，2013

［15］潘晶晶.IAA對棉仁營養品質的影響及其與纖維分化發育間關系的研究［D］.杭州：浙江大學，2014

［16］劉存敬，李延增，李之樹，劉素恩.抗棉鈴蟲棉花雜交種雜交優勢利用研究［J］.華北農學報，2002，17（增刊）：115-119.

［17］郝俊杰.陸地棉雜種優勢及相關性狀的遺傳分析［D］.武漢：華中農業大學，2008.

［18］肖時德，楊秋波.衣分選擇在皮棉增產上的育種意義［J］.湖南農業科學，1995，（4）：3-4.

［19］郭寶生，韓澤林，耿軍義，崔瑞敏，劉素恩，王兆曉，劉存敬，張香云.陸地棉目標性狀育種基因庫的建立與育種利用初探［J］.河北農業科學，2006，10（4）：68-71.

［20］趙會薇，秦焱.棉花吐絮典型外觀形態特性及遺傳穩定性探討［J］.山西農業科學，2014，42（9）：933-937.

［21］劉存敬，江振興，師樹新，張建宏，唐麗媛，田海燕，崔瑞敏，張素君，張香云.陸地棉表型性狀與主要育種性狀的相關性分析［J］.河北農業科學，2015，19（4）：71-76.

Heterosis Analysis and Application for the High Percentage Cotton Germplasm IF1-1 with iaaM

LIU Cun-jing1，JIANG Zhen-xing2，ZHANG Jian-hong1，TANG Li-yuan1，ZHANG Su-jun1，TIAN Hai-yan1，LI Xing-he1，SHI Shu-xin1，CUI Rui-min1，ZHANG Xiang-yun1*
（1.Institute of Cotton，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Cotton in Huanghuaihai Semiarid Area，Ministry of Agriculture，Shijiazhuang 050051，China；2.Hebei Academy of Governance，Shijiazhuang 050031，China）

The high lint percentage germplasm transgenic iaaM lines have been developing，but seldom applied to breeding.We use the high lint percentage germplasm transgenic iaaM lines IF1-1 as the male parents and 16 upland cotton varieties（lines）as female parents to construct the hybrid combinations.We have detected the iaaM hereditary in parents，F1，and F2populations and investigated disease resistance and agronomic traits in the field.Meanwhile through the analysis of the yield components and production statistics in these populations，the hybrid progeny was oriently bred by the means of combination pedigree breeding method and MAS.We have achieved the new germplasm with high lint percentage breeding application.The results showed that（1）FBP7-iaaM gene is dominant gene.（2）Although compared with high lint parents IF1-1，the lint in F1and F2do not have the mid heterosis and heterobeltiosis，it cansignificantlyimprovetheexistingvarieties（lines）lint percentage rate comparing with the 16 female parents varieties（lines）.（3）The F1production has heterosis compared with parents especially in the lint production，the lint yield advantage is 13.4%. That means we could directly select the high production hybrids to use by hybridizing higher yield varieties with IF1-1.（4）The resistance of F1，F2populations is significantly better than IF1-1，but it is worse than the female parent.So we should select the better disease-resistant in the hybrids by observing the incidence of blight and verticillium incidence.（5）By analyzing the advantages traits，indicating that the major increase cotton yield by increasing boll weight and boll number to achieve.But lint yield increasing and improving by the lint and seed cotton yield increased together.（6）The hybrids have high potentiality to selecte new lint lines.The second generation of transgenic cotton germplasm has been obtained，under the support of the national science and technology major projects.In this study，the cotton germplasm is applied to cotton breeding successfully.This is of great significance to improve the level of biological breeding in China.

IaaM；IF-1 line；Heterosis；Application

S512.1+1

A

1008-1631（2016）03-0070-05

2015-12-24

國家轉基因重大專項（2014ZX08005-001-004）；河北省科技支撐計劃項目 （14226312D）；河北省財政重大專項（F15C2015043759）；河北省財政重大專項（F15C2015043752）

劉存敬（1969-），女，河北辛集人，研究員，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：cunjingliu@sohu.com。

基金項目：張香云（1956-），女，河北行唐人，研究員，主要從事棉花育種及新品種示范推廣研究。E-mail：jimianzhang@qq.cn。