茶葉聯苯菊酯原位降解菌株的微生物學特性研究

賀望興　胡桂萍　石旭平　曹揮華　朱運華　張國彪　歐陽雪靈　游艷紅　胡瑤根

(江西省蠶桑茶葉研究所　330202)

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茶葉聯苯菊酯原位降解菌株的微生物學特性研究

賀望興胡桂萍*石旭平曹揮華朱運華張國彪歐陽雪靈游艷紅胡瑤根

(江西省蠶桑茶葉研究所330202)

對前期富集馴化篩選得到的茶園聯苯菊酯降解微生物LB-1進行最佳培養基、生長條件以及對環境的適應性等微生物學特性分析。結果表明:菌株LB-1在牛肉膏蛋白胨加糖培養基、發酵溫度30℃、pH值為7、裝液量30mL的培養條件下生長最快。菌株LB-1在發酵培養基中呈S型生長，在高于2 %的氯化鈉濃度下大量死亡，表明LB-1對高鹽環境不具備良好的適應性。

茶；聯苯菊酯降解菌；Klebsiella sp.；微生物特性

茶葉是我國一種重要的經濟作物，2012年我國茶葉產量居世界第一，出口量居世界第二。隨著生活水平的提高，人們對茶葉食品安全問題越來越重視[1]。調查顯示農藥殘留量超標已成為當前我國茶葉出口和內銷最嚴重的質量安全問題之一。聯苯菊酯是一種人工合成的菊酯類超高效殺蟲、殺螨劑，在我國是代替有機氯和其他劇毒性殺蟲劑的主要農藥類型之一，其使用量僅次于有機磷，占世界殺蟲劑市場的 20%，占我國殺蟲劑施用面積的 1/3 以上[2～3]。但由于聯苯菊酯具有化學性質穩定，農作物利用率低，在環境中不易分解等特點，導致土壤環境和作物上聯苯菊酯殘留嚴重，嚴重危害到人類的健康和生態環境安全[4]。最新研究表明，聯苯菊酯還有蓄毒性，人和動物長期接觸會引起一些慢性疾病[5～6]，且具有致癌、致畸、致突變的危險[7～8]；

自然環境中殘留的農藥主要是通過生物和非生物2種途徑來實現農藥的降解和轉化[9]，而傳統的物理、化學農藥降解方法，往往對儀器和試劑的要求高，成本高，且降解過程中易產生有毒物質，造成二次污染。微生物降解農殘因具有安全、綠色、高效和無二次污染等優點，被認為是處理農藥殘留的一種新型有效的方法[10]。目前國內外研究學者已篩選到大量菊酯類農藥降解菌株，這些菌株歸屬于二十多個種屬[11]。研究發現微生物對農藥的降解方式主要有酶促和非酶促兩種，且以酶促方式為主要形式。國外已有報道環境中的聯苯菊酯可以被微生物通過微生物自身酶系統以及分泌的代謝物作用而被分解[12～13]，國內學者發現聯苯菊酯是被降解微生物作為有機碳源而降解，且聯苯菊酯濃度越高，微生物生長越好[14]。究其原因是微生物通過酶對農藥分子的特殊毒性基團進行代謝，使其失去毒性，并在代謝過程中將農藥分子當作自身需要的碳源物質，從中獲得生長所需的能量[15]。因此土壤微生物在聯苯菊酯的降解過程中發揮著重要作用[16～18]。

針對近年來我國茶產業中菊酯類農藥超標事件頻發，茶葉質量安全現狀堪憂的問題，筆者開展了茶葉聯苯菊酯的農藥殘留降解研究。實驗前期通過富集馴化篩選得到一株適合茶園聯苯菊酯降解的微生物LB-1，克雷伯氏菌Klebsiella sp.，本實驗主要對其進行生物學分析及菌劑開發技術前期工藝研制，以期為進一步提高茶葉綠色清潔化生產技術水平，實現茶葉菊酯類農藥殘留零超標提供理論和技術參考。

1　材料與方法

1.1培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(g/L)(NA)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15～20，pH 7.4～7.6。

牛肉膏蛋白胨加糖培養基(g/L)(NA+S)：牛肉膏3，蛋白胨10，葡萄糖 5，瓊脂15～20，pH 7.4～7.6。

富集培養基(g/L)(EM)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氫二鉀1，葡萄糖1，pH 7.0～7.2。

基礎無機鹽培養基(g/L)(MSM)：磷酸氫二鈉1.5，磷酸二氫鉀1.5，硝酸四氫氮1，硫酸鎂0.2，氯化鈣0.01，硫酸鎂0.001，酵母提取物0.05，pH 7.0～7.2。

PDA培養基(g/L)(PDA)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，pH自然。

1.2實驗方法

1.2.1液體發酵最適培養基優化

將已活化好的菌株LB-1分別以體積分數1%的接種量轉接到裝液量100mL的牛肉膏培養基、牛肉膏加糖培養基、富集培養基、基礎無機鹽培養基、PDA培養基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養。在其他條件保持不變的情況下培養1d，進行單因素試驗。各單因素設計以不接種為對照，每個處理設3個重復，測定不同發酵培養基條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1最佳液體發酵培養基。

1.2.2生長條件優化

將已活化好的菌株LB-1以體積分數1%的接種量轉接到發酵培養基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養。最佳液體發酵工藝條件試驗：分別通過改變發酵基本條件中溫度(15℃，25℃，30℃，35℃，45℃)、pH(2.0，4.0，6.0，7.0，8.0)、裝液量(20mL，30mL，50mL，80mL，100mL)，在其他條件保持不變的情況下培養1d，進行單因素試驗。各單因素設計以不接種為對照，每個處理設3個重復，測定不同發酵參數條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1最佳生長條件。

1.2.3菌株LB-1生長曲線分析

用接種環取一環經過平板活化的菌株LB-1至發酵液體培養基中，在30℃、150r/min的條件下每隔2h取一次菌液，菌液在ODnm600波長下測定其光密度值，繪制菌株LB-1的生長曲線。

1.2.4菌株 LB-1對不同環境的適應性

將已活化好的菌株LB-1分別以體積分數1%的接種量轉接到含不同NaCl濃度(1%,2%,4%,6%,8%)的發酵培養基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養。在其他條件保持不變的情況下培養1d，進行單因素試驗。各單因素設計以不接種為對照，每個處理設3個重復，測定不同NaCl濃度的發酵培養基條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1對不同環境的適應性。

2　結果與分析

2.1液體發酵最適培養基優化

菌株LB-1液體發酵培養基優化結果如圖1所示，菌株LB-1在NA+S培養基中生長最快，OD值為0.545；其次為NM培養基，OD值為0.507；然后是NA培養基，OD值為0.408；接著是PDA培養基，OD值為0.337；而在MSM培養基中生長最慢。這表明菌株LB-1偏好有機碳源和氮源，對無機碳氮利用性差。這可能與有機碳、氮源可以給微生物提供碳、氮源的同時還可以提供豐富的生長因子有關。

圖1　液體發酵最適培養基優化

2.2生長條件優化

2.2.1發酵裝液量優化

菌株LB-1發酵裝液量優化結果如圖2所示，在裝液量達到30mL時，菌株LB-1生長最快，OD值為0.583；隨著裝液量的增加菌株LB-1的生長反而受到抑制，結果表明過多的裝液量會影響菌株LB-1的生長量，這可能是因為裝液量太多發酵液中溶氧量不足，菌生長過程中得不到充足的氧氣。綜合考慮可以確定菌株LB-1發酵最適裝液量為30mL。

2.2.2發酵液pH優化

pH值與生物的生命活動以及新陳代謝密切相關，過高或過低的pH值都不利于微生物的代謝及生長速率，甚至可導致微生物死亡。菌株LB-1發酵液pH優化結果如圖 3所示，LB-1在偏堿性條件下生長較好，其最適生長pH為7，OD值為0.445。當pH值低于6時其生長明顯受到抑制，菌株 LB-1對堿性條件適應性強的特點使之可適用于堿性土壤的修復，具有較大的應用范圍。

圖2　裝液量優化

圖3　發酵液pH優化

2.2.3發酵溫度優化

溫度主要通過影響菌生長、產物形成和合成方向等方面來影響發酵過程。發酵溫度是發酵生產中重要的影響因素，所以必須采用最適宜的溫度來進行發酵。菌株LB-1發酵液溫度優化結果如圖4所示：LB-1在低溫和高溫環境中生長都不好，尤其在低溫環境下菌株LB-1生長幾乎停滯，隨著溫度的提高菌株LB-1生長開始復蘇，在 30 ℃的發酵溫度下LB-1生長最快，OD值為0.345，但發酵溫度再提高菌株LB-1開始衰亡，實驗結果可以確定其最適發酵溫度是30 ℃。

2.3菌株LB-1生長曲線分析

菌株LB-1生長曲線分析結果如圖5所示，菌株LB-1在發酵培養初期(0～2h)細菌由于主要在適應培養環境以及為對數生長期的快速繁殖合成必要的前體物質而生長緩慢，在2～16 h培養時間內菌株處于對數生長期，該期間菌株LB-1快速繁殖，菌濃度越來越高；培養16 h之后菌株進入穩定生長期，菌株生長量與死亡量相平衡，菌濃度變化不大；在培養20 h后由于培養液營養物質消耗殆盡以及有害次生代謝產物的積累導致菌株生長量低于死亡量，細菌進入衰亡期。

圖4　發酵溫度優化

圖5　菌株LB-1生長曲線

2.4菌株LB-1對不同環境的適應性

菌株LB-1對不同環境的適應性結果如圖6所示，菌株LB-1在2 %的NaCl濃度下表現出最好的適應性，OD值為0.418。隨著NaCl濃度的上升，LB-1的適應性越來越差，尤其當NaCl濃度高于6 %時，菌株LB-1的生長量最低，最低時OD值為0.07。研究結果顯示，菌株LB-1對高鹽環境不具備良好的適應性，這可能是因為高鹽環境下菌株LB-1高度失水，導致了LB-1的死亡。

圖6　菌株 LB-1對不同環境的適應性

3　結論與討論

實驗研究了降解聯苯菊酯菌株LB-1的最適生長培養基、生長條件、生長曲線以及對不同環境的適應性，以期為今后的大規模發酵生產應用提供理論參數。研究發現，菌株LB-1以牛肉膏蛋白胨加糖培養基，在發酵溫度30℃、pH值為7、裝液量30 mL的培養條件下生長最快；菌株LB-1在發酵培養基中呈S型生長，在發酵2～16h內處于對數生長期，之后進入穩定生長期，在培養20h后菌株進入衰亡期；菌株LB-1在高于2 %的氯化鈉濃度下大量死亡，表明LB-1對高鹽環境不具備良好的適應性。

最適發酵培養基優化結果與李清云等[20]報道的菊酯降解菌GF31最適碳源為葡萄糖、最適有機氮源為牛肉膏、且在有機氮源的生長情況普遍比無機氮源好的結果相一致。生長條件優化實驗結果與高亞楠等[19]、李清云等[20]報道的高效菊酯降解菌的最適發酵溫度27℃、pH值為7、裝液量40mL基本相符。這表明菊酯類降解菌具有某種對環境條件的相似性。針對實驗室環境條件與室外將降解菌噴灑在茶葉上降解農殘有很大區別，降解菌LB-1如何在室外茶園中發揮相同功效，將是接下來深入研究的方向。

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公益性項目(No.201303094)；江西省科技支撐計劃(20151BBA13042)；公益性行業(農業)科研專項(201303094-08)。