化合物萘對斑馬魚(Daniorerio)發育毒性及基因組DNA甲基化影響的研究

陳宏姍，盛連喜，邊紅楓

(東北師范大學國家環境保護濕地生態與植被恢復重點實驗室，吉林 長春 130117)

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化合物萘對斑馬魚(Daniorerio)發育毒性及基因組DNA甲基化影響的研究

陳宏姍，盛連喜，邊紅楓

(東北師范大學國家環境保護濕地生態與植被恢復重點實驗室，吉林 長春 130117)

萘作為最簡單的多環芳烴化合物，對水生生物有致死致畸作用，并能破壞生物的抗氧化防御系統.選用模式生物雌性斑馬魚成體和胚胎為受試對象進行了萘暴露處理.斑馬魚胚胎發育從受精后3 h開始進行萘溶液染毒處理，處理濃度分別為0(對照組)，1.5，2.5和7.5 μg/L(3個處理組)，至受精后96 h結束.染毒期間觀察胚胎發育的毒理學終點.成年雌性斑馬魚暴露在0，84，840 μg/L的萘溶液中96 h.研究結果表明，萘對斑馬魚胚胎具有發育毒性，受精后24 h凝結率及中樞神經發育異常，有明顯的濃度依賴性.甲基化敏感擴增多態性(MSAP)方法檢測肝臟、腦和肌肉組織受萘脅迫后DNA甲基化水平變化的結果表明，肝臟和腦中DNA甲基化變化水平較肌肉組織高.在肝臟中，DNA甲基化變化水平較對照組分別高出12.88%(84 μg/L處理組)和8.16%(840 μg/L處理組).

多環芳烴；萘；斑馬魚；表觀遺傳；DNA甲基化；MSAP

隨著現代工業、農業的快速發展，新型化合物的種類正在不斷增加，一些殘留期長、環境毒性大或毒性較低但難以分解的化合物，尤其是在環境中長時間積累并對人類健康和周邊生物構成嚴重威脅的持久性化合物(POPs)，如PBDEs，PFOS，PEE以及PAHs等，都屬于此類化學物質.多環芳烴化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是1976年美國環保署(EPA)列出的16項優先控制污染物之一，我國1990年提出的68種水體優先控制污染物中就有7種屬于PAHs.它們對生物具有致癌、致畸、致突變的作用，且物理化學性質穩定，在自然界中難于降解，也是最早被發現和研究的化學致癌物之一[1-2].據統計，到2013年其總排放量已達53萬t[3].萘(naphthalene)是相對分子質量最低的PAHs類化合物，進入水生生態系統的主要渠道是煤焦油生產和蒸餾過程的后續排放以及石油產品和副產品的泄漏[4].20世紀七八十年代，萘作為工業材料被用做家用殺蟲藥(樟腦丸)[5].萘的毒性雖然較低，但分布較廣，對光氧化有較低的敏感性，在水體中有較長的持久性[6]，故也屬于PAHs類污染物，成為環境毒理學和生態毒理學研究中備受關注的化學物質之一.

伴隨著環境問題出現的新變化，研究環境中各種有毒、有害污染物的損害作用及其機理的一門新型交叉學科——生態毒理學發展快速，并成為環境風險管理和環境決策的科學依據和重要基礎[7].這個新學科的形成與方法學的不斷完善密切相關.生物標記法、免疫組織化學法、組學技術(包括蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學)等研究方法不斷完善和發展，推動了分子生態毒理學的形成和發展.其中，化合物對DNA損傷是分子生態學研究的重要內容[8].DNA甲基化測定則是判斷其損傷程度的主要方法.

DNA甲基化是表觀遺傳過程的最重要特征之一，能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達，環境因子通過影響表觀遺傳方式可直接或間接地造成基因表達的改變.一定條件下，DNA甲基化具有可逆性，因而也被稱為“生物進化系統中抵抗環境改變的緩沖器”[9].近10 多年來，該技術因通用性強、操作相對簡便等優點而在毒理學研究中得到了應用[10].劉莉莉等[11]的研究證實，5-脫氧雜氮胞苷可造成DNA的低甲基化；楊建平等[9]對致癌化學污染物的研究發現，TCE，DCA，TCA可誘導小鼠原癌基因表達量上升，同時伴有DNA去甲基化的發生；而在重金屬對魚體內DNA甲基化影響的研究中發現，Cu，Zn，Pb，Cd及其混合重金屬離子能明顯提高鯽魚肝臟DNA、泥鰍DNA的總甲基化水平，且影響程度與Cd，Pb的性質、質量濃度及其作用的靶器官具有相關性[12-13].許多研究證實，甲基敏感擴增多態性實驗(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)是檢測基因組甲基化水平的理想方法，并被廣泛地應用于動、植物基因組的甲基化檢測中[14].

由于魚類可以從水環境中吸收親脂性的有機污染物，因此很多生理效應的變化都可以作為魚類攝入有毒物質后的警示指標，如膽汁代謝物、抗氧化防御系統酶類、微粒體單加氧酶、谷胱甘肽-S-轉移酶水平等生理效應的變化都能作為多環芳烴評價的生理指標[15].此外，這些化合物經過魚類的生物轉化后，導致突變或其他類型遺傳物質的損害[16]；DNA加合物也可以作為損傷性生物標志物來評價污染物的遺傳毒性[17].

斑馬魚(Daniorerio)作為研究對象用于毒理學研究開始于20世紀50年代；90年代后，斑馬魚作為脊椎動物模式生物開始得到廣泛應用，我國的斑馬魚研究也在此后開始進入快速發展期，涉及毒理學研究的文章比例也較高[18].但從表觀遺傳學視野開展的毒理學研究，特別是有關環境污染物危害的表觀遺傳學研究還相對較少.本文以模式生物雌性斑馬魚成體及胚胎(幼魚)為受試對象，探究了萘對成魚各器官基因組DNA甲基化修飾水平及幼魚發育的影響，探討了由此而產生的表觀遺傳學毒性發生機制及其與有毒重金屬所產生的表觀遺傳學改變的異同，以為生態毒性評價提供科學依據.

1　材料與方法

1.1斑馬魚萘暴露處理實驗

1.1.1成年斑馬魚萘暴露處理

選取體重、體長均一的成年雌性斑馬魚(Tubingen品系)，體長(4.0±0.04)cm、體重(0.5±0.02)g，每濃度處理組5尾，設3組重復.實驗容器為5 L燒杯，各組溶液由兩種母液添加海水鹽稀釋而成，總體積4 L，每24 h更換溶液.成年雌性斑馬魚暴露預實驗步驟參照魚類化學暴露標準方法實施[19]，以確定萘對斑馬魚96 h的LC50值.萘為分析純，CN NO.4151；二甲基亞砜(DMSO)，CN NO.82001.先分別配制成84和840 μg/mL萘-二甲基亞砜母液，室溫避光保存.依據毒性預實驗的結果，處理濃度設為溶劑對照組(0.01%二甲基亞砜)，84 μg/L和840 μg/L萘溶液處理組.投入實驗用魚，28℃培養96 h.實體解剖鏡下分別取每個處理組斑馬魚的肝臟、腦和肌肉組織的材料，保存于RNA Store溶液(天根生化科技(北京) 有限公司)中，置于-20℃冰箱，備用.

1.1.2胚胎萘暴露處理

胚胎毒性試驗設計參照國際標準操作指南進行[20].選用發育狀態良好，體長(4.0±0.04)cm、體重(0.5±0.02)g的成年斑馬魚，交配后選出發育完好的受精卵，待發育穩定至受精后3 h進行胚胎的靜態染毒.選用6孔細胞培養板，每孔加入10 mL的對照溶液(0.01%)二甲基亞砜或萘溶液(含0.01%二甲基亞砜).萘暴露處理的濃度分別為 0，1.5，2.5，7.5 μg/L；每個孔內放30枚受精卵，每個濃度設3個平行.然后，將受試胚胎置于27℃的光照培養箱中孵化，光暗比為14/10 h. 染毒后，在倒置顯微鏡下觀察發育至受精后24(24 h pf)，48，72，96 h后的胚胎和幼魚的發育毒理學終點，包括受精后24 h胚胎凝結率、48 h跳速率、72 h神經反射能力和96 h幼魚存活率.

1.1.3數據處理與統計分析

實驗結果以3個平行組的平均值±標準差表示.對每種毒理學指標，采用Origin Lab軟件在對照組和受試組之間進行Oneway-ANOVA分析，P<0.05時認定為存在顯著性差異.

1.2試劑盒法提取斑馬魚肝臟基因組總DNA

取0. 3 g斑馬魚肝臟樣品，按照試劑盒的使用說明提取，最后離心收集得到基因組DNA樣本，-20℃ 凍存備用.DNA提取試劑盒購買于天根生化科技(北京) 有限公司.

1.3甲基敏感擴增多態性實驗

MSAP實驗參考趙娜[21]所采用的方法和實驗步驟進行，包括基因組DNA限制性酶切及連接、預擴增、選擇性擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測、條帶統計和數據整理等.

1.3.1限制性酶切及連接

酶切連接前一天將相應接頭的兩互補鏈1∶1混合，并使EcoRI接頭和HpaII/MspI接頭的10倍母液，終濃度分別為25，250 pmol/μL.雙酶切及連接體系包括：5%接頭，1倍反應緩沖液(reaction buffer)，500 ng模板基因組DNA，1 U的EcoRⅠ，1 U的HpaⅡ/MspⅠ，1 U的T4 DNA連接酶(ligase)，其余為PCR級別實驗用水.37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜.

1.3.2預擴增

以酶切連接產物為模板進行預擴增，反應體系25 μL.之后，94℃預變性5 min，按以下參數擴增 30 個循環：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s.擴增后72℃再延伸 10 min.用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在200～1 000 bp范圍內DNA呈彌散狀分布為最佳酶切連接結果.根據DNA彌散帶的亮度，用0.1×TE 緩沖液(buffer)稀釋預擴增產物10倍至40倍，作為選擇性PCR擴增的DNA模板.

1.3.3選擇性擴增

混勻體系后，按下列參數進行PCR擴增反應：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s；以后每輪循環溫度遞減0.7℃或1℃，擴增12或10輪.而后馬上進行94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，擴增25個循環；擴增后72℃延伸10 min.

1.3.4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染

將以上體系PCR 擴增后的產物進行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色.

1.3.5條帶統計及分析

根據銀染結果統計擴增結果，比較暴露組和對照組在同一等位位點的擴增情況，有條帶記為1，無條帶記為0.

2　實驗結果

2.1萘對斑馬魚的急性毒性半致死濃度

根據預實驗結果，計算出雌性斑馬魚在萘-二甲基亞砜溶液暴露下的半數致死濃度(LC50)值(見圖1A).從圖1可以看出，雌性成年斑馬魚的96 h LC50值為8.4 mg/L，而且萘對斑馬魚毒性作用存在明顯的劑量-效應關系.暴露實驗過程中，對照組未出現異常癥狀；而暴露組加入萘溶液染毒2 min后，斑馬魚表現出異常跳躍、游動不平衡、死亡增高等現象，而且死亡的個體腮部均有明顯充血癥狀，這些中毒反應癥狀的程度隨著萘濃度的升高而越發明顯.

圖1　成年斑馬魚及胚胎-幼魚暴露96 h的存活率

萘對斑馬魚胚胎及幼魚發育毒性實驗結果表明，其96 h LC50為30.8 μg/L(見圖1B)，對受精后24 h 卵凝結率、48 h心臟功能水平、72 h神經反射發育水平與96 h幼魚成活率的影響結果見圖2.斑馬魚胚胎于受精后3 h暴露于萘-二甲基亞砜溶液和空白對照后，24 h卵凝結率與72 h神經發育水平變化與處理濃度表現出明顯的濃度依賴性.空白對照及1.5 μg/L處理組對卵凝結率及神經發育未產生明顯影響(<5%)；濃度增加至7.5 μg/L時，24 h卵凝結率達到42.5%；染毒至受精后72 h，2.5 μg/L和7.5 μg/L處理組只有32.5%和28.5%的幼魚有正常的神經發育，這表明，兩個濃度組中萘對斑馬魚胚胎和幼魚的中樞神經系統發育均有一定影響.各處理組在受精后48 h心臟發育水平上均并未發現異常.受精后96 h成活率對照組為82.5%；7.5 μg/L 處理組的斑馬魚胚胎其存活率下降到65%，而1.5 μg/L 處理組則高達到90%.毒物的這種“低濃度刺激效應”在許多毒理學研究中都有所發現[22-23].

A 24 h卵凝結率，B 48 h心臟發育水平，C 72 h神經發育水平， D 96 h幼魚成活率.

2.2MSAP結果

利用MSAP檢測方法得到了雌性斑馬魚不同組織的甲基化圖譜，結果顯示出3種條帶類型：Ⅰ型是條帶在H(HpaⅡ/ EcoR I)和M(MspⅠ/EcoR I)兩個泳道同時出現，表明CCGG位點沒有甲基化；Ⅱ型是條帶只在H泳道出現，在M泳道缺失，表明CCGG位點半甲基化；Ⅲ型則是條帶在H泳道缺失，而在M泳道出現，表明CCGG位點全甲基化.根據電泳顯示的結果，每個泳道有20～30個片段，長度為50～1 500 bp.其中，條帶清晰的長度為100～750 bp的片段，占總條帶數的90%以上，將這部分片段作為“有意義片段”， 統計雌性斑馬魚3個組織全基因組DNA在CCGG未甲基化的位點、全甲基化的位點和半甲基化的位點占總位點數的比率，結果見表1.

從表1可知，斑馬魚暴露于不同濃度的萘處理組后，各組織中基因組DNA甲基化水平均發生了不同程度的變化.在萘-二甲基亞砜染毒96 h后，斑馬魚肝臟中DNA甲基化水平顯著升高，低濃度處理組(84 μg/L)基因組總甲基化水平達到45.57%，高濃度(840 μg/L)處理組達到了40.85%，分別比對照組升高了12.88%與8.16%.其中，對照組CCGG位點全甲基化16.69%，半甲基化16%；低濃度處理組CCGG位點全甲基化20.8%，半甲基化24.77%；高濃度處理組CCGG位點全甲基化19.51%，半甲基化21.34%.

腦組織的DNA甲基化水平變化趨勢與肝臟較為一致，低濃度處理組(84 μg/L)基因組總甲基化水平達到42.94%，高濃度處理組(840 μg/L)達到39.25%，分別比對照組升高了11.16%與7.91%.其中，對照組CCGG位點全甲基化14.21%，半甲基化17.13%；低濃度處理組CCGG位點全甲基化26.69%，半甲基化16.26%；高濃度處理組CCGG位點全甲基化22.12%，半甲基化17.13%.

表1　雌性斑馬魚組織基因組DNA甲基化水平分析檢測結果

肌肉組織的兩個處理組及對照組之間甲基化水平基本沒有差別，全甲基化和半甲基化位點比例也無差別.但與肝臟和腦組織的甲基化水平相比，肌肉組織的甲基化水平相對較低.

3　討論

胞嘧啶甲基化是脊椎動物重要的表達調控手段，可以抑制相關基因的表達，而且通常呈負調控[24].正常情況下，CpG二核苷酸占有人類基因組的10%，其中70%～80%都為甲基化的CpG位點.未甲基化的CpG二核苷酸僅占全部的2%～3%，通常定位于5末端的啟動子區域，也可以延伸到基因的外顯子區域，以CpG島的形式存在[25].啟動子區DNA甲基化與組蛋白去乙酰化之間具有協同抑制基因轉錄的作用，在功能上等同于遺傳改變，如堿基的突變和缺失[26].DNA甲基化修飾已被確認為是動物癌癥發生過程中的重要機制之一[27].研究表明，癌癥相關基因啟動子區都存在異常的DNA甲基化，說明致病基因表達或關閉都與胞嘧啶甲基化有關[28].已有研究證實，斑馬魚P53基因是化學誘變物的主要攻擊位點，它的突變很可能是腫瘤產生的主要因素[29].本研究中，斑馬魚在遭受到萘急性暴露處理后，各組織CCGG位點甲基化變異水平在高低濃度之間并無顯著性差異.其肝臟及腦組織中甲基化水平明顯升高，可能是很多基因的表達已經被表觀遺傳的這種調控方式關閉所致.這一結果表明，作為PAHs類化合物的萘造成斑馬魚甲基化變異影響的主要是肝臟與腦，其對神經發育及肝臟致癌作用的潛在危害是不容忽視的；但另一方面，胞嘧啶CCGG位點甲基化水平如何作為定量的生物標記還有待于深入研究.

有毒重金屬也可以導致斑馬魚DNA甲基化，而且這方面的研究開展得比較早.朱國念等[12]的研究認為，有毒重金屬也是通過對DNA甲基化水平以及組蛋白的修飾發揮作用的，可能的調控機制是其離子的脅迫導致魚組織的脂質產生過氧化作用，使活性氧自由基不能被清除導致代謝受阻，并引發了DNA鏈的斷裂損傷.因此，重金屬引起DNA的甲基化水平升高可能是細胞保護DNA鏈不被降解的一種自調節方式.相對于重金屬，PAHs污染物萘由于其辛醇-水分配系數較低，因而更容易在水生生物體內富集，能夠引起穩態失調，進入細胞后可能與細胞質中的芳香烴受體(AHR)結合并使之激活后發生構象改變，從而產生相應的生物學效應[30].萘的脅迫可使許多酶如脂質過氧化酶、過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽等重要生化酶類水平的降低[31]，這將導致更多的自由基產生.可見化學污染物的物理化學性質使其參與體內生化反應更直接，影響可能更廣泛.王麗等[32]的研究結果也表明，甲醛參與DNA甲基化可能是通過參與體內四氫葉酸循環實現的.所以，高甲基化水平也預示著DNA分子的過度修飾可能引起其結構和活性受到損害.這雖然與有毒重金屬致毒作用的最終結果相似，但作用機制和路徑可能有所不同，這也是下一步需要研究證實的問題.

以往的研究證明，大部分有機污染物都要經過肝臟參與氧化還原代謝，因而肝臟被認定為多種污染物侵害的靶器官.所以，在一定劑量-時間作用下，也可以根據不同組織器官表觀遺傳調控水平的差異來推斷毒物主要攻擊的靶器官.在本研究中，萘暴露后，斑馬魚肝臟中DNA甲基化水平相對于腦和肌肉組織的變化更為顯著，這可能與肝臟的器官功能有關，使其對污染物吸收富集的數量較其他兩個組織更多.有研究證實，成年雄性斑馬魚暴露于DBP(500 μg/L)7 d或15 d，其肝臟過氧化物酶體增殖[33].肝臟通過生物轉化作用，將有毒物質降解并轉化為沒有活性的基團，使其不能再參與其他的代謝反應，這對于機體的生命活動至關重要，也是保護其他組織和器官的一種有限的“利他”機制.本研究檢測到的變異水平是全基因組范圍DNA甲基化水平，在兩個處理濃度脅迫下，隨著濃度增加甲基化水平變異幅度減小，如再逐漸增加濃度最后可能導致甲基化水平趨于穩定，表現出對污染物不再敏感.這可能是由于器官嚴重損傷或壞死，因而檢測不到變異后表現出的所謂的一種對污染物的“適應行為”.

由于表觀遺傳的調控方式對環境污染物的刺激更為敏感，這在一定程度上對基因組具有保護作用，使外界刺激不能直接作用于遺傳信息，并形成了一道可自動調節與恢復的“屏障保護系統”.當這種系統的調節機制與功能無法發揮作用時，有機污染物就將對機體進入更深層次的和不可逆轉的侵害過程.所以，有必要篩選表觀遺傳調控的生物標記，而且DNA甲基化作為一種監測環境污染物誘導疾病發生的新型分子生物學指標，有可能被應用于診斷、病情監控和預后評價等方面[34].目前的研究已表明腫瘤作為一種基因病，是環境和遺傳的致癌因素所導致的細胞的非致命性損傷，因為它們可以活化原癌基因或使抑癌基因失活.而DNA甲基化也是調控癌癥相關基因表達的重要方式，尤其是在CpG島甲基化水平的調控方面.

4　結論

本文的研究結果表明，斑馬魚不同組織DNA甲基化水平的變異與萘脅迫有直接關系，并可在短期內做出迅速反應，說明用DNA甲基化水平變化來評價萘的毒性影響是可行的.依據“中心法則”DNA→mRNA→蛋白質的信息傳遞路徑，DNA水平調節的評價指標較基因表達水平、酶學水平上的調節將更早也更敏感.因此，以表觀遺傳學方法篩選更靈敏的生物標示物，探測多環芳烴對機體健康傷害后的早期生物學變化將是毒理學研究的一個新方向.本文的研究結果證實，受到萘的脅迫后不同組織出現了各具特異性的甲基化變異，這些變異位點可能就是污染物對該組織器官損傷的甲基化調控熱點及癌癥發生的先前突破點.這些位點的變異是否對同類多環芳烴污染物都有相同的指示趨向性，它們參與了哪些基因表達的調控，將是今后需要關注的重要問題.

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(責任編輯：方林)

Investigation of the effects of developmental toxicity and genomic DNA methylation upon naphthalene exposure in zebrafish(Daniorerio)

CHEN Hong-shan，SHENG Lian-xi，BIAN Hong-feng

(State Environmental Protection Key Laboratory of Wetland Ecology and Vegetation Restoration，Northeast Normal University，Changchun 130117，China)

The naphthalene as the simplest PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons)，is considered to be lethal and teratogenic effects on aquatic organism，also refers to the disruption of antioxidant defense system function. In the present study，adult female zebrafish(Daniorerio) and embryo(Tubingen line) were used to naphthalene exposure tests. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of naphthalene(0，1.5，2.5，7.5 μg/L) from 3 h post-fertilization(hpf) to 96 h pf. During the exposure period，embryo developmental endpoints were examined by microscope. The adult zebrafish were exposed to 0，84 μg/L and 840 μg/L of naphthalene for 96 h. Exposure to naphthalene caused a developmental toxicity，including reduced survival，increased coagulation rates and abnormal 72 h pf response ability in a dose-dependent manner. After the naphthalene exposure，used the MSAP(methylation sensitive amplification polymorphism) analysis to measure the DNA methylation level changes in adult female zebrafish liver，brain and muscle. Higher DNA-methylation level changes showed in the liver and brain than that in muscle. Especially in the liver，DNA methylation level changes in treatment groups are 12.88%(84 μg/L) and 8.16%(840 μg/L) higher than that in control groups respectively.

polycyclic aromatic hydrocarbon;naphthalene；MSAP;zebrafish；epigenetic;DNA methylation

1000-1832(2016)03-0167-07

2015-05-12

國家水體污染控制與治理科技重大專項項目(2008ZX07207-009-03).

陳宏姍(1985—)，女，博士研究生；通訊作者：盛連喜(1961—)，男，教授，博士研究生導師，主要從事于環境生態與濕地保護研究.

X 171.5[學科代碼]610·1040

A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.03.030