血小板反應素蛋白2在高原地區胃黏膜炎性病變及胃癌患者中表達的差異研究

賀春蘭，張夢蘭，楊 勇，茍笑丹，賀菊香，李菊英

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血小板反應素蛋白2在高原地區胃黏膜炎性病變及胃癌患者中表達的差異研究

賀春蘭，張夢蘭，楊 勇，茍笑丹，賀菊香，李菊英

背景血小板反應素蛋白2(THBS2)在成纖維細胞中高表達，在內皮細胞中則缺乏表達。研究顯示，THBS2在正常組織中高表達，在胃癌及成骨肉瘤中表達明顯下降，提示與腫瘤的形成呈負相關。青海位于青藏高原且是胃癌高發區，THBS2在高原地區胃癌患者的表達情況尚未見文獻報道。目的研究THBS2在高原地區患者胃黏膜炎性病變及胃癌組織中的表達情況，探討THBS2與高原地區不同胃黏膜病變間的關系及意義。方法選取2012年12月—2015年2月青海大學附屬醫院腔鏡中心檢查的30例胃黏膜炎性病變患者的標本及青海省人民醫院住院的30例胃癌患者的手術標本〔分別取胃癌組織、癌旁組織(距離胃癌組織5 cm)及正常胃黏膜組織〕，采用組織芯片技術和免疫組織化學方法檢測胃黏膜組織THBS2表達情況，采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測THBS2 mRNA表達情況。比較不同臨床特征患者胃黏膜炎性病變及胃癌組織中THBS2、THBS2 mRNA陽性率的差異。結果免疫組織化學法顯示，THBS2主要表達于細胞質和細胞膜中，呈現黃色或棕黃色染色。胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率較正常胃黏膜組織、胃癌組織升高(P<0.017)。不同性別、年齡、民族、病變性質患者胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。不同性別、年齡、民族、腫瘤大小、有無淋巴結轉移患者胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同分化程度、浸潤深度胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論THBS2可能參與了高原地區人群胃黏膜炎性病變的發生、發展,THBS2表達與胃癌的分化程度、浸潤深度相關，THBS2可以作為胃黏膜炎性病變進展及胃癌預后或觀察療效的指標。

胃腫瘤；胃炎；胃黏膜；血小板反應素蛋白2；高海拔

賀春蘭，張夢蘭，楊勇，等.血小板反應素蛋白2在高原地區胃黏膜炎性病變及胃癌患者中表達的差異研究[J].中國全科醫學，2016，19(26)：3185-3190.[www.chinagp.net]

HE C L,ZHANG M L,YANG Y,et al.Differences in the expression of THBS2 in gastric mucosal inflammatory lesions and gastric cancer tissues of patients on plateaus[J].Chinese General Practice，2016，19(26)：3185-3190.

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發病率和病死率分別居世界第4位和第2位[1]。青海是國內胃癌高發地區之一，由于經濟條件相對落后，大部分胃癌患者就診時已屬于晚期，失去了最佳的治療機會，嚴重威脅當地居民生命健康。胃癌的發生與環境和遺傳有重要關系。研究發現，胃癌的發生從淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→胃黏膜異常增生，發展為胃癌[1],所以，尋找和發現診斷胃黏膜炎性病變的有效因子，對干預和預防胃癌的發生有重要意義。血小板反應素蛋白(thrombospondin，THBS)包括THBS1、THBS2、THBS3、THBS4、THBS5 5個成員，根據結構和功能不同分為A、B兩個亞型，A亞型包括THBS1和THBS2，均具有相同的三聚體結構，由186個氨基酸殘基組成，包括N端球狀結構域、原膠原同源區、備解區重復序列、表皮生長因子樣重復序列、鈣離子結合域、C端球狀結構域。THBS2有多種生物學功能，促進炎性細胞的游出、影響血管的形成、腫瘤細胞浸潤和轉移[2-3]。對于THBS2在高原地區胃黏膜病變患者中研究較少，本研究主要通過檢測THBS2在高原地區患者不同胃黏膜病變組織中的表達情況，探討THBS2在高原地區患者胃黏膜炎性病變的發生、發展以及胃癌形成中作用。

1　材料與方法

1.1材料來源收集2012年12月—2015年2月在青海大學附屬醫院腔鏡中心檢查的30例胃黏膜炎性病變患者標本，放在事先置有冰塊的標本收集包中，結束后置-80 ℃冰箱保存。收集同期青海省人民醫院住院的30例胃癌患者的手術標本，分別取胃癌組織、癌旁組

本文研究背景和創新點：

血小板反應素蛋白2(THBS2)是成纖維細胞、平滑肌細胞等分泌的細胞外基質糖蛋白，具有調節細胞黏附、運動、創口愈合、胚胎發育等功能，同時通過影響血管形成、細胞浸潤和轉移在腫瘤發生、發展中發揮作用。青海是胃癌高發區，同時由于地處青藏高原，具有高海拔、缺氧等環境特點。本研究通過在蛋白水平及基因水平對THBS2在高原、胃癌高發區人群正常胃黏膜組織、胃黏膜炎性病變及胃癌組織中的表達進行研究，發現THBS2在高原地區胃黏膜炎性病變組織中表達升高，而在胃癌組織中表達下降，且與胃癌的分化、浸潤相關，提示THBS2在高原地區參與了胃黏膜炎性病變的發生、發展，但在胃癌的發生中可能是一個保護性因素。本文為探討THBS2在高原地區人群胃黏膜損傷中的作用，預防高原地區胃癌的發生奠定了基礎。

織(距離胃癌組織5 cm)及正常胃黏膜組織1 cm×1 cm，采用10%甲醛溶液固定或放置在-80 ℃冰箱保存?；颊呔醋鲞^任何治療且診斷明確、臨床資料齊全。

1.2試劑THBS2抗體購自Abcam公司，即用型免疫組織化學EliVisionTMplus試劑盒(鼠/兔)購自天根生化科技(北京)有限公司(KIT-9902)，試劑盒由試劑A(增強劑)和試劑B(酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)組成。二氨基聯苯胺(DAB)顯色系統(液體DAB酶底物顯色試劑盒)購自天根生化科技(北京)有限公司，實驗設檢測片和陰性對照片，陰性對照片與檢測片操作方法相同，一抗改用同種IgG，其余條件相同。

1.3方法

1.3.1組織芯片制作將收集的30套胃癌標本做成蠟塊，每個蠟塊選擇2個點，共180個點,制作成組織芯片。采用免疫組織化學的EliVisionTM法檢測THBS2的表達情況。

1.3.2免疫組織化學法檢測THBS2表達30例胃黏膜炎性病變標本制成蠟塊,5 μm連續切片，石蠟切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色進行復診。胃黏膜炎性病變蠟塊切片和組織芯片放置在37 ℃恒溫箱內烤30 min。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復。PBS沖洗3次，滴加3% H2O2溶液后在37 ℃孵育10 min，滴加5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液，室溫孵育20 min。將抗THBS2抗體按1∶50稀釋，37 ℃恒溫箱里孵育1 h。PBS沖洗3次。加兔IgG-HRP二抗，室溫放置40 min，PBS沖洗5次，DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度；蒸餾水沖洗5 min，蘇木素復染40 s，蒸餾水沖洗后，飽和磷酸氫二鈉浸泡2 min返藍，蒸餾水沖洗5～10 min。最后進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封固，顯微鏡下讀片。

1.3.3實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測THBS2 mRNA表達標本置于已加入1 000 μl裂解液的1.5 ml離心管中，用電動高速勻漿機研磨，置冰上5 min,4 ℃ 12 000 r/min離心5 min(離心半徑8.0 cm),上清液轉入新的2 ml離心管中，加200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，冰上放置3 min，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min(離心半徑8.0 cm)，分3層，取無色水相，轉入新的無RNA酶離心管內，加入200 μl的無水乙醇，轉入吸附柱內，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min(離心半徑8.0 cm)，加入500 μl去蛋白液(RD)，4 ℃ 12 000 r/min離心30 s(離心半徑8.0 cm)，加入700 μl漂洗液(RW)室溫靜置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 s(離心半徑8.0 cm)，棄去液體，放入吸附柱，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min(離心半徑8.0 cm)，棄去殘夜。將吸附柱放入新的1.5 ml無RNA酶的離心管內，加入50 μl RNase-Free雙蒸水(ddH2O)，室溫放置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min(離心半徑8.0 cm)，獲得總RNA。在紫外分光光度計上測得RNA濃度。凝膠電泳測得RNA的完整性，棄去不符合要求的RNA。采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉錄為cDNA。采用凱杰生物工程有限公司合成目的引物,以反轉錄的cDNA為模板，GAPDH引物為內參，利用PCR技術擴增THBS2 mRNA，THBS2代碼為QT01671068，引物長度100 bp；GAPDH上游引物為 5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAAG-3′，引物長度496 bp。PCR反應條件95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環；最后72 ℃退火8 min。1.5%凝膠電泳檢測，上樣量5 μl/孔，1.5%凝膠電泳檢測出現的條帶。

1.3.4結果判定免疫組織化學法結果判定：顯微鏡下，THBS2定位于細胞質及細胞膜，染色黃色至棕黃色者為陽性細胞。每張切片觀察5個高倍視野(×40)，每個視野計數200個細胞。結果判斷采用細胞染色比例評分，細胞百分比計算方式為：細胞百分比=陽性細胞數/總細胞數×100%。陽性細胞數≤25%為陰性，≥26%陽性。RT-qPCR法結果判定標準：Mark標記目的基因片段的大小，上樣量5 μl/孔,以內參為參照，在100 bp上出現條帶為陽性。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組織化學法檢測THBS2表達免疫組織化學法顯示，THBS2主要表達于細胞質和細胞膜中，呈現黃色或棕黃色染色(見圖1、2，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.2正常胃黏膜組織、胃黏膜炎性病變組織、胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較正常胃黏膜組織、胃黏膜炎性病變組織、胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率較正常胃黏膜組織、胃癌組織升高，差異有統計學意義(P<0.017，見表1)。

表1　正常胃黏膜組織、胃黏膜炎性病變組織、胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較〔n(%)〕

注：THBS2=血小板反應素蛋白2；與正常胃黏膜組織比較，aP<0.017；與胃黏膜炎性病變組織比較，bP<0.017

圖1　不同胃黏膜炎性病變組織THBS2表達(蘇木素-伊紅染色，×20)

圖2　正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織THBS2表達(蘇木素-伊紅染色，×10)

2.3不同臨床特征患者胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較不同性別、年齡、民族、病變性質患者的胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.4正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表3　正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較〔n(%)〕

表2　不同臨床特征患者胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較

注：均采用Fisher確切概率法

2.5不同臨床特征患者胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較不同性別、年齡、民族、腫瘤大小、有無淋巴結結轉移患者胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同分化程度、浸潤深度胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表4　不同臨床特征患者胃癌組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率比較

注：均采用Fisher確切概率法

3　討論

本研究結果顯示，THBS2、THBS2 mRNA的表達與患者的年齡、性別、民族無關。胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率較正常胃黏膜組織、胃癌組織升高，但與胃黏膜炎性病變性質無關；在胃癌組織中，高分化者THBS2、THBS2 mRNA陽性率高，浸潤深度達到黏膜及肌層者THBS2、THBS2 mRNA陽性率高，THBS2、THBS2 mRNA陽性率與淋巴結轉移無明顯相關。

青海地區高寒缺氧，胃腸道是對缺氧環境較敏感的器官之一，由于長期低氧環境，引起胃黏膜出血、壞死、炎性細胞浸潤等病理性變化，從而使胃黏膜自我保護屏障受損，是誘發胃黏膜病變主要病理生理基礎,同時也是高原地區慢性胃炎，尤其是慢性萎縮性胃炎高發原因之一[4]。長期損傷可以引起胃黏膜增生及誘導炎癥發生，使局部微環境發生變化，為腫瘤的發生創造了條件。所以，大多數學者認為腫瘤是長期慢性炎癥的結果。世界衛生組織把胃潰瘍、胃黏膜腸上皮化生、胃黏膜異常增生等胃黏膜病變列為癌前病變。

THBS2屬于THBS家族成員之一，由成纖維細胞、平滑肌細胞等分泌的分子量為20 kD的細胞外基質糖蛋白，位于6q27染色體上[5]。由3條多肽鏈組成同源三聚體，具有與凝血酶、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、肝素等物質結合的多個位點，與多種細胞受體、生長因子、細胞間基質蛋白結合，調節細胞的黏附、移動、創口的愈合、胚胎的發育[6]。同時在腫瘤發生、發展中起著重要作用。有文獻報道，敲除THBS2基因的實驗小鼠皮膚張力降低，骨密度增加，皮膚及其他組織的小血管密度增加，提示THBS2與細胞的黏附與遷移有關[7]。有文獻顯示，在結腸癌組織中THBS2的表達明顯高于正常組織[8]。STREIT等[9]研究提示，高表達的THBS2可以抑制腫瘤血管的密度和數量的增加并促進腫瘤細胞的凋亡。HAWIGHORST等[10]將皮膚化學致癌物質作用于野生型和THBS2缺失型小鼠，發現在惡性腫瘤發生過程中野生型小鼠間質THBS2表達明顯上調，THBS2缺失型小鼠的腫瘤生長速度顯著加快，提示THBS2在腫瘤發生過程中表現出來的表達上調是宿主的一種自身抗腫瘤防衛機制。本研究采用組織芯片技術和免疫組織化學方法檢測胃黏膜組織THBS2表達情況，采用RT-qPCR法檢測THBS2 mRNA表達情況，結果發現，胃黏膜炎性病變組織THBS2、THBS2 mRNA陽性率較正常胃黏膜組織、胃癌組織升高，THBS2、THBS2 mRNA表達與胃癌的分化程度及浸潤深度有關，不論從蛋白水平還是基因水平，均得到了證實，與既往文獻報道一致[11]。THBS2抑制內皮細胞增生、分裂,從而抑制腫瘤血管的形成，在低分化胃癌組織中THBS2表達低，失去了抑制內皮細胞分裂、增生的能力，形成腫瘤血管，供給腫瘤細胞營養[12]。盡管在腫瘤發生過程中腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子(VEGF)等細胞因子，VEGF可以阻斷THBS2對介導caspase活化但不能阻斷THBS2對血管內皮細胞DNA合成的抑制，VEGF能阻斷THBS2介導內皮細胞的凋亡，但不能阻斷THBS2對內皮細胞分裂周期的抑制，所以，即使在VEGF、表皮細胞生長因子(EGF)等因子存在的環境中，THBS2依然是一種有效的非caspase依賴型的血管內皮細胞抑制劑，隨著腫瘤分化程度的降低，THBS2分泌減少，表達降低，腫瘤間質大量的血管形成，為胃癌細胞的生長和轉移創造了條件[13-14]。胃黏膜在缺氧環境下受到損傷，引起胃黏膜病理性改變，導致THBS2的分泌增加，改變胃黏膜的微環境，可以刺激其他細胞因子釋放并參與炎性反應。有文獻報道，在角膜損傷的6 h內，THBS2分泌增加，24 h降低至最低，96 h出現第2次增加，192 h降到參考值水平，THBS2在損傷的作用下細胞結合部位肌動蛋白表達增強，黏合斑中a肌動蛋白丟失，細胞進入去黏合狀態，這種狀態為其他一些特殊因子參與炎性損傷與修復提供了微環境[15]。

綜上所述，在高原地區患者THBS2可能參與了胃黏膜炎性病變發生和發展，在炎癥發生時改變了胃黏膜局部的微環境，THBS2也可通過抑制腫瘤血管的形成，影響腫瘤的分化與浸潤。因此，進一步研究THBS2對高原地區患者胃黏膜的損傷作用，對預防高原地區胃癌的發生有著重要的意義。

作者貢獻：李菊英進行課題設計；賀春蘭進行資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張夢蘭、楊勇、茍笑丹進行課題實施、評估、資料收集；賀菊香進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Differences in the Expression of THBS2 in Gastric Mucosal Inflammatory Lesions and Gastric Cancer Tissues of Patients on Plateaus

HEChun-lan,ZHANGMeng-lan,YANGYong,GOUXiao-dan,HEJu-xiang,LIJu-ying.QinghaiUniversityAffiliatedHospital，Xining810001,China

Correspondingauthor：LIJu-ying,DepartmentofPathology，MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810001,China；E-mail：lijuying@126.com

BackgroundTHBS2 is highly expressed in fibroblasts but is insufficiently expressed in endothelial cells.THBS2 is also highly expressed in normal tissues,but its expression in gastric cancer and osteogenic sarcoma is decreased.Thus,THBS2 expression is negatively correlated with tumor formation.A high incidence of gastric cancer is recorded in Qinghai Province on Qinghai-Tibet Plateau.However,the expression conditions of THBS2 in gastric cancer patients on plateaus have yet to be reported.ObjectiveTo investigate the expression conditions of THBS2 in gastric mucosa inflammatory lesions and gastric cancer tissues of patients on plateaus and to explore the relationship and significance between THBS2 and different gastric mucosa lesions of patients on plateaus.MethodsSpecimens were collected from 30 cases with gastric mucosal inflammatory lesions inspected by the Endoscopy Center of Qinghai University Affiliated Hospital.Surgical specimens were also obtained from 30 gastric cancer patients admitted to Qinghai Provincial People′s Hospital from December 2012 to February 2015.The specimens were taken from gastric cancer tissues,para-carcinoma tissues located 5 cm away from gastric cancer tissues,and normal gastric mucosal tissues.The expression of THBS2 in gastric mucosal tissues was detected through tissue microarray and immunohistochemical analysis.The mRNA expression of THBS2 was determined through RT-qPCR.Differences in positive rates between THBS2 and its mRNA in gastric mucosal inflammatory lesions and gastric cancer tissues with various clinical features were then compared.ResultsImmunohistochemical analysis revealed that THBS2 is mainly expressed in the cytoplasm and the cell membrane,as indicated by yellow and claybank stains.The positive rates of THBS2 and its mRNA in gastric mucosal inflammatory lesions were significantly higher than those in normal gastric mucosa and gastric cancer tissues(P<0.017).The positive rates of THBS2 and its mRNA in gastric mucosal inflammatory lesions in different genders,ages,nationalities,and lesion types did not significantly differ(P>0.05).The positive rates of THBS2 and its mRNA in normal gastric mucosa,para-carcinoma tissues,and gastric cancer tissues did not also significantly differ(P>0.05).Likewise,the positive rates of THBS2 and its mRNA in gastric cancer tissues of patients with different genders,ages,nationalities,tumor sizes,and metastatic or non-metastatic lymph nodes did not significantly vary(P>0.05).By comparison,the positive rates of THBS2 and its mRNA in gastric cancer tissues with various degrees and depths of invasion significantly differed(P<0.05).ConclusionTHBS2 may be involved in the occurrence and development of gastric mucosal inflammatory lesions among patients on plateaus.THBS2 expression is highly associated with the differentiation degrees and invasion depths of gastric cancer.Therefore,THBS2 can be considered an indicator of the development of gastric mucosal inflammatory lesions and prognosis of gastric cancer or observation of curative effects.

Stomach neoplasms；Gastritis；Gastric mucosa；THBS2;Altitude

青海省科技廳計劃與研究課題資助項目(2012-Z-720)

810001青海省西寧市，青海大學附屬醫院(賀春蘭，楊勇，茍笑丹)；青海省人民醫院(張夢蘭)；青海大學醫學院病理教研室(賀菊香，李菊英)

李菊英，810001青海省西寧市，青海大學醫學院病理教研室；E-mail：lijuying@126.com

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.012

2016-02-26；

2016-07-15)