阿魏酸酯酶對曬青毛茶發(fā)酵過程的影響

雷林超,趙明雙,龍宣蓉,陳培欽,李夏蘭

(華僑大學 化工學院，福建 廈門，361000)

黑茶是一種獨特的微生物發(fā)酵茶，其生產(chǎn)僅限于中國和日本[1-2]。黑茶包括普洱茶、茯磚茶、青磚茶和黑毛茶。黑茶質(zhì)量和風味與參與茶葉發(fā)酵的微生物密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)普洱茶在渥堆過程中有黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉、酵母等微生物存在，黑曲霉約占微生物總數(shù)的80%左右，普洱茶發(fā)酵渥堆過程中黑曲霉代謝產(chǎn)生的有機酸和酶對普洱茶品質(zhì)的形成有著重要的作用[4-5]。目前，發(fā)酵型茶中活性物質(zhì)關(guān)注較多的是生物堿類、多酚類、有機酸、黃酮類、醌類等[1]，對阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)的研究還較少。FA是植物中普遍存在的一種酚酸。FA具有抗氧化活性、抗動脈粥樣硬化、抗血栓、降低膽固醇和降血脂等許多生物功能[6]。阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73 feruloyl esterase，F(xiàn)AE)，是羧酸酯水解酶的一個亞類，其主要生物功能是水解多糖與FA連接的酯鍵，釋放FA[7-8]。劉閆等[9]報導了冠突散囊菌產(chǎn)FAE及其在黑毛茶可釋放FA的實驗結(jié)果，但是其FA含量極低。本課題組前期的研究及其他學者的報導都已證實FAE與木聚糖酶協(xié)同降解植物細胞壁時，植物細胞壁中釋放的FA是僅木聚糖酶或FAE單獨作用的多倍，且能同時釋放FA和具有生物活性的低聚木糖(xylooligosaceharides，XOS)[10-13]。將這一思想應用于茶葉發(fā)酵的研究，本文報道了在曬青毛茶中添加FAE及木聚糖酶，發(fā)酵毛茶制備富含F(xiàn)A和XOS的黑茶實驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青毛茶,云南普洱寧普景邁茶廠；黑曲霉,實驗室保藏菌種；麥麩、次粉,廈門海嘉面粉有限公司；木聚糖酶、茶氨酸標準品(純度≥98%),大連美侖生物技術(shù)公司；甲醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；阿魏酸乙酯標準品(純度≥97%)、木糖(純度≥98%)、FA標準品(純度99%),美國Macklin公司；木聚糖標準品,愛爾蘭Megazyme公司；瓊脂,安徽Biosharp公司；(NH4)2SO4(分析純)，英國Oxoid公司；MgSO4(分析純)，上海國藥集團；其他材料均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA pH計，上海Mettler Toledo公司；4K15高速冷凍離心機，美國Sigama公司；SB-3200DT超聲儀，寧波新芝生物科技公司；LC-2010高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，美國Thermo Electron公司；UV-6100紫外分光光度計，上海美譜達公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 FAE粗酶液的制備

按課題組已建立的方法制備FAE粗酶液[14]。菌種為實驗室自行篩選的黑曲霉。

1.3.2 木聚糖酶粗酶液的制備

按課題組已建立的方法制備[13]。

1.3.3 發(fā)酵黑茶的制備

取500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min,每組3個平行實驗，按表1加入各材料，對照組為6 mL的無菌水，28 ℃培養(yǎng)8 d。每天定時從錐形瓶中取樣，40 ℃恒溫干燥后測定酶化發(fā)酵茶葉中活性物質(zhì)的變化。

表1 曬青毛茶的酶化發(fā)酵制備黑茶實驗Table 1 Preparation of black tea by enzymatic fermentation of sun-dried tea

注：FAE、木聚糖酶酶活均為75 U/mL。

1.3.4 檢測方法

(1)茶湯的pH值測定

取發(fā)酵的茶樣1 g，按質(zhì)量加入50倍煮沸的去離子水，浸泡5 min，過濾，取茶湯，冷卻至25 ℃，測pH值[15]。

(2)茶葉水浸出物含量的測定

按《GB/T 8305—2013茶水浸出物的測定》[16]分析。

(3)還原糖含量的測定

稱取1 g固體茶葉粉末，按質(zhì)量加入8倍水，50 ℃ 浸提1 h，用8層紗布過濾，將濾液在4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min，取上清液，用DNS法測還原糖含量[17]。

(4)游離氨基酸含量的測定

按《GB/T 8314—2013茶游離氨基酸總量的測定》[18]分析。

(5)FAE酶活力的測定

按課題組已建立的方法測定[13]。酶活定義：在50 ℃、pH 6.0條件下,每分鐘酯解阿魏酸甲酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

(6)FA含量的測定

稱重1 g茶葉，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm膜過濾3次后，HPLC法測定FA含量[19]。

(7)茶葉感官評審

按《GB/T 23776—2018 茶葉感官審評方法》[20]，請職業(yè)評茶員評定。

(8)XOS含量測定

采用HPLC法。色譜柱為AminexHPX-42A柱，柱溫85 ℃，示差折光檢測器，流動相為超純水，流速0.6 mL/min[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵后曬青毛茶功效成分的變化

2.1.1 茶葉活性物質(zhì)含量變化分析

發(fā)酵8 d后，測定了茶樣的水浸出物質(zhì)量分數(shù)、游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)及茶湯pH值，結(jié)果如表2所示。

表2 發(fā)酵后茶葉的活性物質(zhì)含量Table 2 Active substance content of fermentation tea

如表2所示，發(fā)酵8 d后，添加FAE和木聚糖酶的茶樣3其含水浸出物質(zhì)量分數(shù)最高，為57.3%，高于曬青毛茶(50.9%)及其他茶樣的水浸出物含量。茶樣1、茶樣2及茶樣4水浸出物含量接近，說明單獨添加FAE或木聚糖酶對茶樣的水浸出物影響不大，而添加FAE和木聚糖酶的茶樣3比空白茶樣4高6.2%，說明在FAE和木聚糖酶的協(xié)同作用下，茶葉可釋放出更多的水溶性物質(zhì)。茶葉的品質(zhì)由茶葉水浸出物含量決定，水浸出物中的生化成分、種類以及比例越高，則茶葉品質(zhì)越高[21]。實驗表明，在茶葉中添加FAE以及木聚糖酶有助于提高水浸出物含量，從而提高茶葉的品質(zhì)。

酶化發(fā)酵后4個茶樣的游離氨基酸遠低于曬青毛茶(2.49%)，均下降了50%以上。這是因為氨基酸在茶葉發(fā)酵的過程中與兒茶素和糖類相互作用，發(fā)生了一系列的氧化、降解等轉(zhuǎn)化反應，且氨基酸作為氮源物質(zhì)被微生物利用，故曬青毛茶在發(fā)酵過程中氨基酸呈下降趨勢[22]。其中同時添加了FAE和木聚糖酶的茶樣3含游離氨基酸質(zhì)量分數(shù)最低，為1.07%，這是因為在FAE和木聚糖酶的協(xié)同作用下，植物中的木質(zhì)纖維降解較為徹底，茶葉中有更多的糖類和酚酸被釋放出來，且互相反應，造成了發(fā)酵過程中茶樣3中的氨基酸下降較其他兩個茶樣更多。呂海鵬等[23]報導氨基酸在發(fā)酵結(jié)束后除了蛋氨酸和脯氨酸有提高以外，其余的氨基酸都大幅度降低，降幅達到80%以上，總氨基酸較原料減少50%左右，這與本研究結(jié)果相同。

發(fā)酵后茶樣的pH值在5.05～5.46，低于曬青毛茶的pH值5.56，說明發(fā)酵后茶湯中的H+增多，使原本呈弱堿性的去離子水在浸泡茶葉之后呈酸性，與郭桂義等[24]的研究一致。研究表明，有機酸是糖類分解代謝的中間產(chǎn)物，在茶葉沖泡過程中大多數(shù)可被浸出到茶湯中，成為影響茶湯香氣和滋味品質(zhì)的主要成分之一[25]。茶樣3的pH值最低，可能是茶樣3 FA釋放量最高導致。

2.1.2 還原糖含量變化分析

經(jīng)測定曬青毛茶的還原糖質(zhì)量分數(shù)為2.97%。如圖1所示，隨著發(fā)酵時間的變化，4個茶樣還原糖的含量先升高后降低，發(fā)酵第6天時還原糖含量皆最高。這是因為實驗時盡管沒有另外添加發(fā)酵菌種，但曬青毛茶及空氣中的微生物在茶葉發(fā)酵過程中生長代謝，將茶葉中的大分子碳水化合物分解成小分子的可溶性糖類物質(zhì)[26]。在第6天時還原糖又緩慢下降，這是因為到發(fā)酵后期茶葉中的可溶性糖與氨基酸發(fā)生了美拉德反應，使還原糖含量下降[27]。圖1也顯示，在4個茶樣中添加FAE和木聚糖酶的茶樣3含還原糖質(zhì)量分數(shù)最高,為4.97%，8 d后還保持在3.77%左右。這可能是由于在FAE和木聚糖酶的協(xié)同作用下，茶葉中木質(zhì)纖維降解相對于單獨添加FAE或木聚糖酶的茶樣1和茶樣2更易降解，從而釋放更多的可溶性糖類[7]。

圖1 發(fā)酵后茶葉還原糖含量隨時間的變化Fig.1 Changes of reducing sugar content in tea leaves with different times of fermentation

2.1.3 FA含量變化分析

曬青毛茶的FA含量為487.3 μg/g。如圖2所示，4個茶樣的FA的含量都高于曬青毛茶，且隨著發(fā)酵時間的延長FA含量增大，在第5天FA含量最高，隨后呈下降趨勢，茶樣1的FA含量比茶樣2和茶樣4高，添加了FAE和木聚糖酶的茶樣3的FA含量最高，為1 120 μg/g, 較空白對照茶樣4高出180.29 μg/g，比曬青毛茶高出632.7 μg/g。課題組前期將FAE應用于麥糟及纖維飼料的降解，結(jié)果表明單獨添加FAE及木聚糖酶都可釋放FA，且在FAE和木聚糖酶的協(xié)同作用下可明顯提高了FA的釋放率，但隨著時間的延長，由于FA易分解、易氧化的特性，F(xiàn)A釋放量隨后下降[28]。本實驗結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵時間對茶葉的FA含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on FA content in tea

2.1.4 XOS含量變化分析

經(jīng)測定曬青毛茶的低聚木糖含量為1.82 μg/g。如圖3所示，4個茶樣的XOS的含量都高于曬青毛茶，且隨著發(fā)酵時間的延長，XOS含量增大，在第6天XOS含量最高，隨后呈下降趨勢，且同時添加了FAE和木聚糖酶的茶樣3的XOS含量最高，為4.05 μg/g，較空白對照茶樣4高出1.02 μg/g，比曬青毛茶高出2.23 μg/g。說明單獨加入FAE或木聚糖酶與空白對照茶樣4相比，可少量釋放XOS，且FAE與木聚糖酶有協(xié)同作用，有助于茶葉中的木質(zhì)纖維降解，本實驗室的前期研究也表明FAE有利于麥糟及纖維飼料中XOS的釋放[28]。本實驗結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果一致。

圖3 發(fā)酵時間對茶葉XOS含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on XOS content in tea

2.2 茶葉感官評審結(jié)果

評茶員從外形、香氣、滋味、湯色、葉底5個方面對茶樣進行感官評審比較，結(jié)果見表3。

經(jīng)過發(fā)酵后的4個茶樣，與曬青毛茶相比，其皆顏色較深，香氣更濃郁，苦澀減弱，湯色由黃綠變?yōu)楹旨t。其中茶樣3的茶湯香氣更為豐富和醇厚，評分最高。

表3 不同條件發(fā)酵茶葉的感官評審Table 3 Sensory evaluation of fermented tea under different conditions

3 結(jié)論

本實驗表明發(fā)酵后茶湯的pH值及游離氨基酸含量都呈下降的趨勢，游離氨基酸含量下降了50%左右。發(fā)酵8 d后茶葉的水浸出物、還原糖、FA及XOS均比曬青毛茶高。發(fā)酵后4個茶樣的FA及XOS含量皆隨著時間的增加先升高后下降，且同時添加了FAE和木聚糖酶的茶樣3在第5天FA最高達到1.12 mg/g，在第6天XOS最高可達4.05 μg/g。發(fā)酵結(jié)束的第8天FA和XOS分別可達838.9 μg/g及3.78 μg/g，比不添加任何酶的茶樣分別高20.9%及38.6%。從茶樣感官評分 來看，同時添加了FAE和木聚糖酶的茶樣3感官評分也最高。因此，在曬青毛茶發(fā)酵過程中，同時添加FAE和木聚糖酶，盡管對茶葉的pH值、還原糖、水浸出物、游離氨基酸、FA、XOS等有著不同程度的影響，但可明顯提高茶葉中的具有生物活性物質(zhì)的FA和XOS含量，有利于提高茶葉的品質(zhì)和附加值。