微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀與多管法的對(duì)比及應(yīng)用

高心崗　張　芳

(青島佳明測(cè)控科技股份有限公司，青島 266000)

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微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀與多管法的對(duì)比及應(yīng)用

高心崗張芳

(青島佳明測(cè)控科技股份有限公司，青島 266000)

微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀是基于國(guó)標(biāo)方法酶-底物法研制的，可以同時(shí)檢測(cè)水體中菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌四項(xiàng)指標(biāo)的快速檢測(cè)設(shè)備。本研究采用該微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀，用標(biāo)準(zhǔn)菌液對(duì)儀器本身性能進(jìn)行了驗(yàn)證，并采用多點(diǎn)采集的飲用水及水源水水樣進(jìn)行了微生物四項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，儀器檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)傳統(tǒng)方法中的多管發(fā)酵法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示該檢測(cè)儀的測(cè)定結(jié)果與多管發(fā)酵法具有較好的相關(guān)性，能滿足多種水樣實(shí)際檢測(cè)的要求，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短(大腸菌群 ≤12h、菌落總數(shù)≤18h)、靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)飲用水及水源水常規(guī)微生物四項(xiàng)指標(biāo)的快速檢測(cè)及篩查，并起到預(yù)警作用。

水中微生物菌落總數(shù)檢測(cè)儀快速測(cè)定

生活飲用水的質(zhì)量關(guān)系著千家萬(wàn)戶人民的身體健康，隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重，關(guān)乎人們身體健康的飲水問(wèn)題也變得越來(lái)越重要。生活飲用水的安全飲用微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法規(guī)定了菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌等四項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，并規(guī)定飲用水中菌落總數(shù)不得超過(guò)100CFU/mL；而當(dāng)飲用水中總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌一旦檢出就意味著該飲用水已被污染，不得飲用。

目前，國(guó)內(nèi)普遍采用《GB/T5750.12-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》來(lái)檢測(cè)生活飲用水中常規(guī)四項(xiàng)指標(biāo)，其具有準(zhǔn)確性好、可靠性高等特點(diǎn)，但是前期需要做大量的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作，操作過(guò)程也較為繁瑣，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能獲得檢測(cè)結(jié)果，不適用于突發(fā)性公共衛(wèi)生應(yīng)急事件和實(shí)時(shí)對(duì)飲用水、水源水進(jìn)行全天候高頻率安全監(jiān)測(cè)。因此十分有必要研究適合水質(zhì)常規(guī)四項(xiàng)微生物檢測(cè)指標(biāo)快速檢測(cè)的方法。

微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀是以國(guó)標(biāo)方法里的酶-底物法為原理基礎(chǔ)研制的，可以同時(shí)檢測(cè)水體中菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌四項(xiàng)指標(biāo)的快速檢測(cè)設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短(大腸菌群 ≤12h、菌落總數(shù)≤18h)、靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，有較高的實(shí)用價(jià)值。本研究采用該微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀，用標(biāo)準(zhǔn)菌液對(duì)儀器本身性能進(jìn)行了驗(yàn)證，并采用多點(diǎn)采集的飲用水及水源水水樣進(jìn)行了微生物四項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，儀器檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)傳統(tǒng)方法中的多管發(fā)酵法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示該檢測(cè)儀的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)傳統(tǒng)方法多管發(fā)酵法具有較好的相關(guān)性，能滿足多種水樣實(shí)際檢測(cè)的要求，可用于對(duì)飲用水及水源水常規(guī)微生物四項(xiàng)指標(biāo)的快速檢測(cè)及篩查，并起到一定的預(yù)警作用。

1　材料與方法

1.1樣品

實(shí)驗(yàn)水樣品采自青島市白沙河、青島市嶗山水庫(kù)、本實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水。白沙河樣本與嶗山水庫(kù)樣本取自水面下30cm處，水體置于滅菌500mL玻璃廣口瓶中，封口、編號(hào)帶回實(shí)驗(yàn)室。自來(lái)水樣本取自經(jīng)出水口滅菌的實(shí)驗(yàn)室水龍頭，置于滅菌500mL玻璃廣口瓶中。

1.2試劑

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC培養(yǎng)液等均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3菌種及菌懸液制備

大腸埃希氏菌(ATCC25922)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

將37℃培養(yǎng)24h的大腸埃希氏菌斜面挑取適量菌體于無(wú)菌生理鹽水中，充分混合，并逐步稀釋至菌懸液濃度為107～108cfu/mL待用。

1.4儀器

多管發(fā)酵法：中試管、發(fā)酵管、500mL廣口瓶、玻璃培養(yǎng)皿、生物安全柜、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、載玻片、接種環(huán)和恒溫培養(yǎng)箱。

微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀法：微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀JMA-SZS-MP-1，由青島佳明測(cè)控科技股份有限公司提供。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1多管發(fā)酵法(國(guó)標(biāo)法)

多管發(fā)酵法參照HJ/T347-2007《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定-多管發(fā)酵法和濾膜法》，具體步驟如下：

(1)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：

將原液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀釋。依次吸取1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000各1mL分別注入內(nèi)裝有小發(fā)酵管和10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，將已接種的發(fā)酵管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽(yáng)性。

(2)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。在44.5℃±0.5℃溫度下培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣泡證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性，按陽(yáng)性管數(shù)查表。

1.5.2微生物快速監(jiān)測(cè)儀法(儀器法)

微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀是基于酶-底物法為原理設(shè)計(jì)的，結(jié)合微生物、光、機(jī)、電、機(jī)械多領(lǐng)域技術(shù)研發(fā)而成，儀器使用一次性培養(yǎng)基，具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。測(cè)定步驟如下：把待測(cè)水樣100 mL加入測(cè)試指標(biāo)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)檢測(cè)瓶?jī)?nèi)，放入檢測(cè)儀指定槽位，按操作要求設(shè)置后開(kāi)始自動(dòng)檢測(cè)，視水樣濃度高低，幾個(gè)小時(shí)后結(jié)果自動(dòng)在顯示屏幕上出現(xiàn)已測(cè)水樣結(jié)果。

1.5.2.1酶-底物法原理

待測(cè)微生物指標(biāo)在最適溫度下培養(yǎng)生長(zhǎng)，產(chǎn)生特定的酶可水解培養(yǎng)基中不同的底物生成有色物質(zhì)。本系統(tǒng)采用的培養(yǎng)基能夠與該種特定酶生成不同的有色化合物，通過(guò)進(jìn)行連續(xù)的分光光度測(cè)定，依據(jù)待測(cè)水樣色度變化并與水中的待測(cè)指標(biāo)成一定關(guān)系，建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型即可得出待測(cè)微生物指標(biāo)的濃度。

1.5.2.2一次性培養(yǎng)基

儀器通過(guò)連續(xù)光度檢測(cè)培養(yǎng)基，根據(jù)色度變化結(jié)合算法得出最終待測(cè)指標(biāo)的結(jié)果。

1.6數(shù)據(jù)分析

待測(cè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果先轉(zhuǎn)換為常用對(duì)數(shù)，然后采用下式比較兩種方法之間的差異，以實(shí)際偏差小于±30%作為可接受的結(jié)果。

式中：A-多管發(fā)酵法測(cè)定結(jié)果；

B-儀器法測(cè)定結(jié)果。

將檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)換為常用對(duì)數(shù)，輸入excel 2003，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀實(shí)驗(yàn)室參數(shù)驗(yàn)證

2.1.1準(zhǔn)確性驗(yàn)證

制備總大腸菌群，耐熱大腸菌群，菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的最高濃度。利用微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線，重復(fù)6次，如圖1所示。將標(biāo)準(zhǔn)菌懸液稀釋8個(gè)濃度梯度，用微生物四項(xiàng)儀檢測(cè)儀檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線如圖2所示。用微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀檢測(cè)不同濃度菌群測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。然后系列稀釋5個(gè)濃度梯度至較低濃度，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。用多管發(fā)酵法與微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀法平行檢測(cè)并計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出微生物四項(xiàng)儀的加標(biāo)回收率在83.33%～118.57%。同時(shí)從圖2可以看出，該方法能在12小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出低至100 CFU/mL的菌落總數(shù)及1 CFU/100mL的大腸菌群。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)菌懸液生長(zhǎng)濃度梯度生長(zhǎng)曲線

圖2　8個(gè)梯度濃度的菌懸液生長(zhǎng)曲線

圖3　不同濃度菌群測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1　微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀檢測(cè)3種指標(biāo)加標(biāo)回收率　%

2.1.2精密性與重復(fù)性驗(yàn)證

制備總大腸菌群，耐熱大腸菌群，菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確讀數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋5個(gè)濃度梯度至較低濃度。每一個(gè)濃度用微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀進(jìn)行10 次平行檢驗(yàn)，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)分析方法得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)偏差在10.95%～27.19%之間。

表2　3個(gè)水樣檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差　%

2.2微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀對(duì)3種水樣檢測(cè)結(jié)果

分別以國(guó)標(biāo)法和四項(xiàng)微生物檢測(cè)儀法對(duì)3個(gè)水樣的4種微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算準(zhǔn)確度，白沙河水樣檢測(cè)結(jié)果如表3所示，嶗山水庫(kù)水樣如表4所示，自來(lái)水水樣如表5所示。

表3　白沙河水樣檢測(cè)結(jié)果　%

表4　嶗山水庫(kù)水樣檢測(cè)結(jié)果　%

續(xù)表4

表5　自來(lái)水水樣檢測(cè)結(jié)果　%

3　討論

本研究使用的微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀，采用酶底物法的原理，在一個(gè)儀器上實(shí)現(xiàn)了菌落總數(shù)，總大腸菌群，耐熱大腸菌群和大腸桿菌埃希氏菌四項(xiàng)常規(guī)的微生物指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，對(duì)于快速檢測(cè)水質(zhì)微生物污染提供了一種新的技術(shù)手段。但其具體的檢測(cè)性能還沒(méi)有相關(guān)的研究。

本研究首先制備了標(biāo)準(zhǔn)濃度的大腸埃希氏菌懸液來(lái)驗(yàn)證微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀的性能，從圖2和圖3結(jié)果可以看出，儀器測(cè)試得到的菌種生長(zhǎng)曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)。進(jìn)一步的測(cè)試顯示四項(xiàng)檢測(cè)儀的加標(biāo)回收率在83.33%～117.39%。等效方法的檢驗(yàn)結(jié)果均大于國(guó)標(biāo)方法的70%。從精密性與重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果可知標(biāo)準(zhǔn)偏差在10.95%～27.19%之間，均小于35%。說(shuō)明微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀用于水質(zhì)微生物檢測(cè)結(jié)果可靠，具有可行性。且同傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)法相比較，具有檢測(cè)時(shí)間短,小于12小時(shí)，操作更為簡(jiǎn)便，無(wú)需確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。

用微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀對(duì)3個(gè)不同來(lái)源的實(shí)際水樣進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)確度在-17.1%～36.5%之間，說(shuō)明微生物四項(xiàng)檢測(cè)儀具有很好的實(shí)用價(jià)值。由于其檢測(cè)時(shí)間顯著短于多管發(fā)酵法，該儀器可用于及時(shí)有效的發(fā)現(xiàn)突發(fā)性水污染事件，從而有效防止突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。

雖然在今后一段時(shí)間內(nèi)，傳統(tǒng)方法與新技術(shù)將并存的局面還難于改變，但隨著科技進(jìn)步，自動(dòng)化檢測(cè)方法將是環(huán)境監(jiān)測(cè)工作的發(fā)展方向。精確、快速、可靠的檢測(cè)儀器將會(huì)得到應(yīng)用與普及。

[1]GB7959-1987.糞便無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]闞方琦,馬樂(lè)好,王方木,薛彥明.檢測(cè)食(飲)品大腸菌群紙片法與發(fā)酵法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007,17(7):1300-1301.

[3]唐漪靈,郭奕芳,吳翊,沈蕾.Petrifilm紙片法和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)奶制品細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)的結(jié)果比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000,10(3):325-327.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).《中國(guó)藥典》(2010版).北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

Comparison and application of microbial four-parameter detector and multi tube method.

Gao Xingang,Zhang Fang

(Qingdao Jiaming Measurement and Control Tech.Co.Ltd.,Qingdao 266000,China)

The compared results showed that the detector had a good correlation with the multiple tubes fermentation method.The determination was rapid (total coliforms ≤12h and total bacteria ≤18h).It can replace the tubes fermentation method to detect the four microbial indicators in water.

microorganisms in the water;total bacteria;detector;rapid determination

項(xiàng)目：國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專項(xiàng)(2013YQ060721)

高心崗，男，1968年出生，本科，高級(jí)工程師，長(zhǎng)年從事環(huán)保在線監(jiān)測(cè)儀器開(kāi)發(fā)工作，Email：13006525021@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.04.014

2015-12-23