蜂蜜中煙曲霉素殘留的測定

曹葳蕤　魏　月　吳黎明（中國農業科學院蜜蜂研究所 農業部蜂產品質量檢測中心，北京100093）

蜂蜜中煙曲霉素殘留的測定

曹葳蕤魏月吳黎明
（中國農業科學院蜜蜂研究所 農業部蜂產品質量檢測中心，北京100093）

本文建立并優化了蜂蜜中煙曲霉素的HLPC－MS/MS分析方法。該方法的檢出限為2 μg/kg，線性范圍為1～1000 μg/L，R2為0.9992，在三個加標水平下，回收率在72.09～92.09%之間，批內和批間相對標準偏差分別在2.7～10.32%和5.2～11.1%。方法適用于蜂蜜中煙曲霉素殘留的測定。

蜂蜜；煙曲霉素；分析方法

1　前言

近年蜜蜂微孢子蟲在全世界流行，尤其是近十幾年發現的東方蜜蜂微孢子蟲，對蜂產業造成了嚴重損失［1］。煙曲霉素被認為是治療蜜蜂微孢子蟲病特效藥［2］，它是從煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）中分離的一種抗生素，具有突出的抗寄生蟲效果［3］。然而由于知識產權、貿易保護等因素，蜂用煙曲霉素還沒有在我國授權使用。為了爭取煙曲霉素能被我國農業獸藥管理部門允許在蜂群中使用，充分發揮其在治療日益嚴重的蜜蜂微孢子蟲病中的作用，避免甲硝唑等禁用藥物的使用，有必要開展煙曲霉素在蜂產品中代謝降解規律等基礎性研究。

關于煙曲霉素殘留的分析方法已有一些報道［4-8］，主要有酶聯免疫法、高效液相色譜串聯質譜法（HPLCMS/MS），液相色譜質譜法（HPLC/MS），高效液相色譜法（HPLC）。其中高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）結合了高效液相色譜和串聯質譜的優點，分離能力強、選擇性好、靈敏度高，能達到更好檢出限，其多反應監測掃描模式 （Multi-reactions monitoring，MRM）的選擇性高。因此本文選擇高效液相色譜串聯質譜法對蜂蜜中的煙曲霉素進行研究。

本實驗優化了蜂蜜中煙曲霉素的提取和HPLCMS/MS分析條件，建立了適用于高通量分析蜂蜜中的煙曲霉素殘留的測定方法。為研究煙曲霉素在蜂巢體系和蜂產品中的變化規律研究提供了方法支持。

2　材料、試劑與儀器

2.1主要材料、試劑

蜂蜜，北京香山地區產

C18固相萃取小柱（6 ml/500 mg，美國Waters公司）；

Oasis HLB固相萃取柱（6 ml/500 mg，美國Waters公司）；

QuEChERS試劑盒（美國Agilent公司）；

Zorbax SB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；

Zorbax XDB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；

Poroshell 120SB-C18色譜柱 （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純（美國MREDA technology公司）；

水為超純水，用milli-Q超純水系統制備（美國Millipore公司）。

2.2標準品

煙曲霉素標準品CSA：23110-15-8，1 mg，純度98%（北京百靈威科技有限公司），用1 ml甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg/ml的煙曲霉素貯備液，保存于-20℃冰箱中備用。

2.3儀器與設備

Agilent 6460高效液相色譜串聯質譜儀（美國安捷倫公司）；

固相萃取裝置（美國Waters公司）；

CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本日立公司）；

N-EVAP112氮氣吹干儀（美國OA-SYS公司）；

QB-210試管翻轉混合器（海門市其林貝爾儀器公司）；

Milli-Q純水機（美國Millinpore公司）。

2.4標準溶液的制備

用甲醇稀釋將濃度為1.0 mg/ml煙曲霉素標準儲備液稀釋成1000 μg/L、500 μg/L、200 μg/L、100 μg/L、10 μg/L 和1 μg/L的工作液。

2.5色譜條件和質譜條件

2.5.1高效液相色譜條件

色譜柱：PoroshellSB-C18柱（2.1×100 mm，2.7μm）；

流動相：0.1%甲酸水溶液（A）+乙腈（B）；

流速：0.2 ml/min；

梯度：0min，45%B；3～6.5min，90%B；6.6～15 min，45%B；

柱溫：30℃；

進樣量：5 μl。

2.5.2質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，檢測方式采用多反應監測（MRM）模式，氣體溫度（Gas Temp）300℃，氣體流速（Gas Flow）6 L/min，噴霧器壓力（Nebulizer）45 psi，鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）350℃，鞘氣流速（Sheath Gas Flow）9 L/min，毛細管正電壓3500 v。

2.6樣品處理方法

取5 g蜂蜜樣品用10 ml純水溶解，8000 r/min離心5 min。吸取上清液于Oasis HLB固相萃取柱（使用前用5 ml甲醇和5 ml純水活化）中進行凈化。樣品溶液全部流出后，用10 ml純水淋洗HLB小柱，負壓下抽干，用6 ml乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干，用1ml甲醇復溶，將溶液過0.22 μm尼龍濾膜后待測。對于超過線性濃度樣品，稀釋后重新測定。

3　結果和討論

3.1儀器條件的優化

3.1.1色譜柱的選擇

由圖1煙曲霉素的結構可知，煙曲霉素是一種弱極性物質，一般采用反相色譜柱對其進行分析。文獻報道中一般采用苯基柱和C18柱等反相色譜柱來分離［6］。本研究對三種不同的色譜柱進行比較：Zorbax SB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），Zorbax XDB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），Poroshell 120，SB-C18（2.7 μm，100 mm× 2.1 mm）。如圖Poroshell 120，SB-C18的可以得到滿意分離效果、較高靈敏度以及良好的峰型。最終，選擇Poroshell 120，SB-C18作為本次試驗的色譜柱。

圖1　煙曲霉素標樣的TIC圖

3.1.2流動相及洗脫梯度的優化

為了得到最佳的色譜分離效果，提高煙曲霉素測定的靈敏度，本研究對流動相和添加物進行了優化。首先對流動相的組成進行了優化，比較了使用純水-乙腈，純水-甲醇，0.1%甲酸水-乙腈，0.1%甲酸水-甲醇作為流動相后，色譜峰的保留時間與峰形。結果表明，乙腈作為有機相，其響應值比甲醇高，出峰時間早，這可能是由于乙腈的極性比甲醇強的緣故。流動相中分別加入0.05%、0.1%、0.5%的甲酸，發現0.1%的甲酸可以明顯提高正模式下母離子加氫峰的強度。

然后對洗脫梯度進行優化，最終確定流動A為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min，45%B；3～6.5 min，90%B；6.6～15 min，45%B。在該梯度洗脫程序下，峰形尖銳，響應較高。

3.1.3質譜條件的優化

為了得到最好的定量響應，首先將煙曲霉素的標準溶液（1.0 μg/ml），通過電噴霧離子化直接進入質譜進行一級全掃描分析，分別嘗試了三種模式：正模式下加酸（ESI+），負模式下加酸（ESI－）以及負模式下不加酸，發現在正模式加酸的條件下得到的響應值最高，因此選擇正離子監測模式，得到其穩定的［M＋H］+和碎片。在此過程中對一些質譜參數進行優化，確定最優的碎裂電壓（Fragmentor Voltage）、碰撞能量（Collision Energy）等，以獲最大靈敏度。然后在多反應監測模式（MRM）下對其碎片離子進行全掃描，如圖2，得到了4個峰值較大的離子碎片∶m/z427，m/z265，m/z232，m/ z176，滿足歐盟指令（2002/657/EC）中利用質譜方法對藥物殘留進行分析確證必須滿足4個識別點的要求［9］。由于m/z 427是煙曲霉素脫水形成的 ［M-H2O］＋，不穩定，m/z232峰度比較小，因此選擇質荷比（m/z）分別為265.1和 176.9，其中 m/z 179.6作為定量離子，m/z 265.1作為定性離子。

圖2　煙曲霉素全掃描質譜圖

3.2前處理方法優化

3.2.1QuEChERS方法與固相萃取方法的選擇

選擇合適的萃取方式及萃取柱是決定固相萃取效率的關鍵因素，可以實現對樣品的凈化濃縮，降低基質的干擾，從而改善待檢測物質的離子化程度，提高檢測方法的選擇性和靈敏度。

基質效應是指出目標物質外的其他成分對于定量分析的綜合影響，一般認為是待測組分與樣品基質成分在霧滴表面離子化過程中存在競爭所導致，會對目標物的離子化效率，使離子強度增加或降低，從而影響檢出限、定量限以及測定結果的準確性［10］。本研究中向空白基質中添加一定濃度的煙曲霉素標準品，通過比較實際測定濃度與所添加濃度的比值來評價基質影響。若比值大于1，則基質效應表現為基質增強（用“+”表示），若比值小于1，則表現為基質抑制（用“-”表示）。一般情況下，基質影響可接受范圍為-20%～10%。

本文章比較了QuEChERS方法與固相萃取方法（Oasis HLB、C18）的提取效果。稱取5.0 g蜂蜜溶于10 ml去離子水中，配制成0.5 g/ml的蜂蜜溶液作為樣品溶液。樣品溶液平行準備3組，每組3份。分別采用上述三種方法對3組蜂蜜樣品進行前處理后，向每組的3份平行的蜂蜜樣品中分別添加10、50、100 μg/L的標準溶液，進行后續實驗操作，對比四種方法的回收率及基質效應。結果見表1。

表1　QuEChERS、Oasis HLB、C18提取結果對比

由表1可知，三個方法都表現為基質抑制。采用QuEChERS方法對目標物進行提取，回收率較低，且基質效應嚴重，低濃度添加水平時基質影響尤為突出，嚴重干擾了測定結果的準確性。而且，如果研究樣品批次多、樣品量大，若對每批次樣品分別進行基質校正，會影響檢測結果的重復性。QuEChERS方法雖然具有快速、簡單的優勢，更適用于目標物質的快速篩查。煙曲霉素降解代謝等規律的研究需要對目標物質準確定量，因此QuEChERS方法并不適用。

由表1可知，采用固相萃取方法的Oasis HLB和C18柱子提取煙曲霉素時，凈化效果好，回收率均高于QuEChERS方法，沒有明顯的基質效應，因此本研究選擇固相萃取作為提取方法。由結果可知，Oasis HLB柱子在三個添加濃度下的回收率均高于C18柱，對目標物的保留能力較C18柱高。因此，本研究選取HLB柱子對蜂蜜中的煙曲霉素進行提取。

3.2.2淋洗溶液和洗脫溶液的選擇

參考相關文獻［10］淋洗溶液對純水、2%的甲醇、10%的氨水進行比較，由圖3可知，純水的淋洗對回收率的損失較小，效果最好。

本研究對洗脫溶液（甲醇、乙腈、乙酸乙酯）進行了篩選，并對洗脫液體積進行了優化。對比甲醇、乙腈、乙酸乙酯的洗脫效果可知，甲醇、乙腈洗脫物較多，測定時存在雜質干擾，且目標物回收率低。乙酸乙酯洗脫物種類少、洗脫效果好，目標物質回收率高，因此實驗中選擇乙酸乙酯作為洗脫溶液。分別采用2、3、4、5、6、7、8、9、10 ml乙酸乙酯對固相萃取柱進行洗脫，對比回收率，結果見圖4，洗脫液體積由2 ml增加至6 ml時，回收率逐漸升高，此后體積增加，回收率無明顯變化，說明6 ml乙酸乙酯已洗脫完全，因此，本實驗選取6 ml乙酸乙酯作為洗脫溶液。

圖3　淋洗溶液的優化

圖4　洗脫溶液體積的優化

3.3方法評價

3.3.1線性范圍及檢出限

以水為溶劑稀釋煙曲霉素儲備液，配制質量濃度為1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L的標準系列標準溶液，按照2.4中優化的實驗條件進行測定。以定量離子的峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，線性范圍在1～1000 μg/ml之間（相關系數R2=0.9992，線性方程y=13.087x-607.94）。配制接近方法檢出限的標準樣品，重復測定7次，以信噪比為3時對應的質量濃度作為的方法的檢出限，為2.0 μg/kg，與以往研究相比，靈敏度更高。

3.3.2方法的添加回收率、精密度

空白蜂蜜樣品中添加一定濃度煙曲霉素儲備液，分別制成5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg，每個加標水平做5個重復，連續做3 d，蜂蜜中煙曲霉素加標回收率、批內精密度和批間精密度結果見表2。三個水平添加回收率分別為 80.37～92.09%，78.51～90.32%，72.09～81.86%，日內精密度分別為5.6%、2.7%、10.3%，日間精密度分別為9.5%、5.2%、11.1%，均小于20%。

表2　煙曲霉素的添加回收率、精密度

4　結論

本文采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/ MS）技術及固相萃取技術，建立并優化了蜂蜜煙曲霉素殘留的檢測分析方法。經方法學驗證：煙曲霉素在1～1000 μg/L范圍內，均具有良好的線性關系，線性相關系數（r）為0.9992，本文建立的檢測方法檢出限為2μg/ kg。在5 μg/kg、10μg/kg和50μg/kg三個加標水平下，回收率在72.09～92.09%之間，批內相對標準偏差在2.7～10.32%之間，批間相對標準偏差在5.2～11.1%之間。本方法操作簡單、靈敏度高適用于大批量蜂蜜中煙曲霉素殘留檢測。

［1］Meghan OM，Toan T，WeiFong H，et al.Comparative virulence and competition between Nosemaapis and Nosemaceranae in honey bees （Apis mellifera）.Journal of Invertebrate Pathology.2015，125（2）: 9-15.

［2］Huang WF，Solter L，Yau P，et al.Effects of Fumagillin on Nosemaceranae Infections in Honey Bees（Apismellifera）［J］. American Bee Journal，2013，153（8）:885-886.

［3］McCowen M C，Callender ME，Lawlis J F.Fumagillin（H-3），a newantibioticwithamebicidalproperties.Science，1951，113，202-203.

［4］Lopez MI，Pettis JS，Smith IB，et al.Multiclass determination and confirmation of antibiotic residues in honey using LC-MS/MS［J］. Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2008，56（5）:1553-1559.

［5］Kanda M，Sasamoto T，Takeba K，et al.Rapid determination of fumagillin residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using the QuEChERS method［J］.Journal of AOAC International，2011，94（3）:878-899.

［6］Dmitrovic J，Durden DA.Analysis of fumagillin in honey by LC-MS/MS［J］.Journal ofAOACInternational，2013，96（3）:687-695.

［7］Assil HI，Sporns P.ELISA and HPLC methods for analysis of fumagillin and its decomposition products in honey［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39（12）:2206-2213.

［8］Nozal MA，Bernal JL，Martin MA，et al.Trace analysis of fumagillin inhoneybyliquidchromatography-diodearray-electrospray ionization mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2008，1190（1-2）: 224-231

［9］Commission Decision 2002/657/EC of the 12th August，2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerningtheperformanceofanalytical methods and the interpretation of result，Official Journal，2002，L221:8

［10］許森.復雜基質樣品中抗生素的實時直接分析質譜篩查技術研究［D］.中國地質大學（北京），2015.

Determination of fumagillin residues in honey

Cao WeiruiWei YueWu Liming
（Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences Bee Product Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100093，China）

Abstract∶A method was developed to determinate fumagillin in honey using HPLC-MS/MS.The method was validated∶limit of detection（LOD）was 2 μg/kg；R2was 0.9992 when the linear ranged from 1 to 1000 μg/L；and the recoveries were between 72.1%and 92.1%with the intra-RSD of 2.7～10.3%and inter-RSD of 5.2～11.1%at three spiked levels.The developed method has been used to detect fumagillin residue in real samples.

honey，fumagillin，analytical method

吳黎明，E-mail:apiswu@126.com，Tel：010-62594643。