2-甲氧基雌二醇聯合冬凌草甲素對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響*

李銀英，陳成群，張振中

1)鄭州大學第二附屬醫院藥學部 鄭州 450014　2)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052　3)鄭州大學藥學院 鄭州450001

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2-甲氧基雌二醇聯合冬凌草甲素對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響*

李銀英1)，陳成群2)，張振中3)#

1)鄭州大學第二附屬醫院藥學部 鄭州 4500142)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 4500523)鄭州大學藥學院 鄭州450001

2-甲氧基雌二醇；增殖；凋亡；胃癌；聯合用藥；SGC-7901細胞

目的：研究2-甲氧基雌二醇(2-ME)單獨和聯合冬凌草甲素對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響。方法：用0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L 2-ME處理SGC-7901細胞24、48和72 h后，觀察細胞形態變化，SRB法檢測2-ME對SGC-7901細胞增殖的抑制作用；用0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L 2-ME以及相同濃度的冬凌草甲素單獨或聯合應用處理SGC-7901細胞48 h后，計算結合指數，用流式細胞術和熒光染色法觀察細胞凋亡情況。結果：2-ME作用于SGC-7901細胞48 h的IC50值為5.31 μmol/L，對細胞SGC-7901的抑制作用呈時間依賴性,與冬凌草甲素聯合應用的IC50值為8.46 μmol/L。不同濃度2-ME作用48 h，隨著劑量增加，SGC-7901細胞凋亡率增加，聯合應用冬凌草甲素對細胞凋亡的影響未表現出協同作用。結論：2-ME可以抑制SGC-7901細胞的增殖，誘導其凋亡，與冬凌草甲素聯合應用時對腫瘤細胞增殖的抑制表現為相加作用，對凋亡未表現出協同作用。

惡性腫瘤是當今社會嚴重威脅人類生命的主要因素之一，傳統的化學藥物治療毒性大，療效差，研究發掘高效低毒的治療藥物和方法成了近期人們關注的焦點。2-甲氧基雌二醇(2-methoxy estradiol,2-ME) 是雌二醇在體內的生理代謝產物[1-2]，廣泛存在于人類血液和尿液中，能選擇性殺傷腫瘤細胞，對正常細胞基本沒有毒性以及對雌激素受體無依賴性。2-ME得到了國內外學者的廣泛研究，目前正在進行多種腫瘤治療的臨床試驗，是一種很有前景的抗腫瘤藥物。冬凌草甲素是從冬凌草等植物葉子中提取出的一種貝殼杉烯二萜類化合物，具有較好的抗腫瘤活性。研究[3-4]證實2-ME可以將腫瘤細胞阻滯在G2/M期。而冬凌草甲素也能通過將腫瘤細胞阻滯于G2/M期而達到抗增殖的作用[5]，作者考慮二者聯合用藥可能有相加作用。該研究以胃癌SGC-7901細胞為研究對象，初步考察了2-ME與冬凌草甲素單獨和聯合用藥對SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑2-ME(由鄭州大學藥學院新藥合成課題組自制，純度>99%)，以二甲基亞砜(DMSO)配制成64 mmol/L的原藥儲備液，0.22 μm濾器除菌，4 ℃保存，臨用時用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液稀釋成所需濃度；冬凌草甲素(購自北京鼎國昌盛生物技術公司，純度﹥99%)，以DMSO配制成64 mmol/L的原藥儲備液，4 ℃保存備用；RPMI 1640購自鄭州科諾生物技術有限公司；胰蛋白酶購自基諾生物醫藥術有限公技司；胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司；硫基羅丹明蛋白染料(SRB)購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和Hoechst33342-PI雙染檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2細胞培養SGC-7901細胞培養于含有體積分數10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和0.1 kg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，2～3 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3SRB法檢測2-ME對SGC-7901細胞增殖的影響取處于對數生長期的SGC-7901細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，調整細胞濃度，5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后棄去培養液，加入含不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)2-ME的培養液，每孔反應體系0.2 mL，空白對照組以RPMI 1640培養液補足，每組設6個復孔，繼續分別培養24、48、72 h后，倒置顯微鏡下進行形態學觀察。用預冷的三氯乙酸(TCA)固定細胞10 min，移入4 ℃環境下靜置1 h后，除去固定液，每孔用去離子水洗5遍，自然晾干。每小孔中加100 μL SRB染色，室溫避光放置15 min,棄去染液，用體積分數1%冰醋酸將未結合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。結合的SRB用Tris堿液150 μL溶解，用全自動酶標儀在515 nm處測定每孔光密度(OD)值，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4SRB法檢測2-ME和冬凌草甲素對SGC-7901細胞增殖的影響取處于對數生長期的SGC-7901細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，調整細胞濃度，5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后棄去培養液，分別加入含以下濃度藥物的培養基：0.625、1.250、2.500、5.000 μmol/L 2-ME和相同濃度的冬凌草甲素，以及2-ME與冬凌草甲素以上濃度的混合液，于培養箱中作用48、72 h后，按上述SRB法處理96孔板中細胞，再測定每孔OD值，按1.3中方法計算細胞增殖抑制率，最后計算每組IC50值，采用Chou-Talalay 法[6]，計算結合指數(combination index,CI)，CI<1.0時表示協同作用,CI=1.0時表示相加作用,而CI>1.0時則表示拮抗作用。

2　結果

2.1不同濃度2-ME作用不同時間后SGC-7901細胞增殖抑制率測定結果見圖1。不同濃度2-ME作用SGC-7901細胞48和72 h，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖抑制率逐漸增加。不同濃度2-ME作用SGC-7901細胞24 h時，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖抑制率有先增加后降低的趨勢。相同濃度2-ME作用于SGC-7901細胞的增殖抑制率表現出時間依賴性。

圖1　不同濃度2-ME作用不同時間后對SGC-7901細胞增殖的抑制作用

2.2不同濃度2-ME作用48 h SGC-7901細胞形態變化結果見圖2。存活細胞數目隨2-ME濃度增大而減少,且藥物作用后細胞形態與空白對照組相比發生明顯變化，細胞變圓、皺縮，有凋亡小體生成。

A：0.500 μmol/L 2-ME；B：2.000 μmol/L 2-ME；C：4.000 μmol/L 2-ME；D：16.000 μmol/L 2-ME；E：對照。圖2　不同濃度2-ME作用48 h SGC-7901細胞形態變化

2.32-ME和冬凌草甲素對SGC-7901細胞增殖的影響見圖3。不同濃度的2-ME和冬凌草甲素作用SGC-7901細胞48 h后，均表現不同程度增殖抑制作用，兩者聯合用藥也對細胞有明顯增殖抑制作用，2-ME對SGC-7901的IC50值為5.31 μmol/L，冬凌草甲素對SGC-7901的IC50值為18.14 μmol/L，兩者聯合用藥IC50值為8.46 μmol/L，CI為0.989，兩者聯合作用48 h后，對SGC-7901細胞增殖的抑制有相加作用。

A：2-ME；B：冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素。圖3　2-ME和冬凌草甲素單獨與聯合作用SGC-7901細胞48 h后的細胞增殖抑制率

2.4流式細胞儀檢測2-ME和冬凌草甲素對SGC-7901細胞凋亡的影響0.625、2.500、10.000、20.000 μmol/L的2-ME誘導的凋亡細胞占細胞總數分別為(15.46±0.88)%、(23.42±1.44)%、(35.97±1.69)%、(38.74±2.69)%，呈明顯濃度依賴性；2.500 μmol/L冬凌草甲素誘導細胞凋亡率為(12.68±1.34)%；2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液誘導細胞凋亡率為(13.15±1.25)%，介于單獨應用2-ME和冬凌草甲素之間，未呈現協同作用。

2.52-ME和冬凌草甲素對SGC-7901細胞凋亡影響的Hoechst33342/PI雙染檢測結果熒光倒置顯微鏡結果(圖4)顯示細胞凋亡呈明顯濃度依賴性，與流式細胞儀檢測結果一致，而2.500 μmol/L冬凌草甲素和2-ME混合液誘導的凋亡明顯少于2.500 μmol/L 2-ME且多于2.500 μmol/L冬凌草甲素引起的凋亡，與流式細胞儀結果一致。兩藥聯合應用并未呈現協同作用。

A：2.500 μmol/L 2-ME；B： 2.500 μmol/L冬凌草甲素；C：2-ME和冬凌草甲素混合液；D：細胞對照。圖4　Hoechst33342/PI 雙染檢測2-ME和冬凌草甲素對SGC-7901細胞凋亡的影響結果(×200)

3　討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其病死率居各類惡性腫瘤之首，且多數患者為進展期胃癌[7]。聯合化療為其治療的重要手段，但療效差，同時化療對機體有毒副作用，比如骨髓抑制、免疫抑制、胃腸道反應等。許多患者因為耐受不了而放棄治療，更有一些身體狀況不佳的患者因化療而加速死亡，因此必須尋求新的藥物配伍方案。

2-ME主要是抗血管新生，可將腫瘤細胞周期阻滯在G2/M期。作者用SRB法檢測了不同濃度的2-ME對胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用，結果表明，2-ME在低濃度范圍內對細胞的抑制作用隨時間的延長而降低，而在濃度較大范圍內則隨時間的延長而增強；作用48、72 h具有濃度依賴性，而作用24 h在小于2 μmol/L范圍內抑制率隨濃度升高而增大，在大于2 μmol/L范圍內抑制率隨濃度升高而減小。這說明2-ME只是在一定濃度范圍內對細胞的增殖抑制所用呈時間-濃度依賴性，具體原因可能和細胞的自噬有關[8]。自噬又稱程序性死亡，是一個受嚴格調節的細胞內容物的降解和再循環的過程，參與了細胞器的代謝和再利用以及對細胞內的生物能量的補充。作為一種細胞生存的機制，自噬在很多生理過程如抵抗營養缺乏、 清除過剩或損壞的細胞器上發揮著重要的作用。自噬可能拮抗或延遲細胞凋亡 ,因為在一些情況下，自噬能通過清除損傷的線粒體而減弱凋亡的信號傳導，另外，細胞凋亡和自噬可能作為彼此的后備機制從而執行不可逆的細胞死亡信號的傳遞[9]。

2-ME和冬凌草甲素都能夠將腫瘤細胞阻滯在G2/M期，兩者聯用可能對細胞增殖抑制具有相加作用。作者的研究結果顯示，2-ME和冬凌草甲素CI為0.989，接近于1，證實兩者確實具有相加作用。流式細胞儀和熒光染色凋亡實驗結果顯示細胞凋亡率隨2-ME藥物濃度的升高而增加，呈現明顯的濃度依賴性。而在2.500 μmol/L兩者聯合用藥的細胞凋亡率高于2.500 μmol/L的冬凌草甲素而低于2.500 μmol/L的2-ME單獨應用，此結果也與抑制增殖試驗中聯合用藥組抑制率數值介于2-ME組和冬凌草甲素組之間一致。

總之，2-ME可以抑制SGC-7901細胞的增殖，誘導其凋亡，與冬凌草甲素聯合應用對腫瘤細胞的抑制表現為相加作用，對凋亡未表現出協同作用。

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(2015-12-26收稿責任編輯李沛寰)

Effect of 2-methoxy estradiol and oridonin on proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells in vitro

LIYinying1)，CHENChengqun2)，ZHANGZhenzhong3)

1)DepartmentofPharmacology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofPharmacology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500523)CollegeofPharmacology,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2-methoxy estradiol；proliferation；apoptosis;gastric cancer;SGC-7901 cell

Aim: To study the effect of 2-methoxy estradiol(2-ME) separate and combined with oridonin treatment on proliferation and apoptosis of gastric cancer strain SGC-7901 in vitro. Methods: SGC-7901 cells were treated with 0.125,0.250,0.500,1.000,2.000,4.000,8.000,16.000 μmol/L 2-ME for 24, 48 and 72 h, cells morphological changes were observed,and SRB assay was applied to detect the SGC-7901 cell growth; with different concentration (0.625,2.500,10.000,20.000 μmol/L)2-ME and the same concentration oridonin separately treatment on SGC-7901 cells for 48 h, the combination index was calculated,and the apoptosis of the cells by flow cytometry and fluorescent staining was observed. Results: TheIC50of 2-ME acted on SGC-7901 cells was 5.31 μmol/L, and the inhibitory effect of 2-ME on SGC-7901 cells was concentration- and time- dependent. After being treated by different concentrations of 2-ME for 48 h, the apoptosis rate of SGC-7901 cells was increased with the increase of the dose, and the effect of 2-ME on apoptosis had no synergistic. Conclusion: 2-ME can inhibit the proliferation of SGC-7901 cells, induce apoptosis, and enhance the effect of oridonin.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.012

，男，1964年11月生，博士，教授，研究方向：腫瘤靶向治療，E-mail：zhangzz08@126.com

*國家自然科學基金資助項目81573364

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