SK2和JPH2雙基因重組真核表達載體的構建及在HEK293細胞中的表達*

羅天霞，樊紅琨，芮丹丹，孫佳翕，馬小芳，章　茜#

1)鄭州大學基礎醫學院生理學教研室 鄭州 450001　2)新鄉醫學院基礎醫學院 新鄉 453000

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SK2和JPH2雙基因重組真核表達載體的構建及在HEK293細胞中的表達*

羅天霞1)，樊紅琨1)，芮丹丹1)，孫佳翕2)，馬小芳1)，章茜1)#

1)鄭州大學基礎醫學院生理學教研室 鄭州 4500012)新鄉醫學院基礎醫學院 新鄉 453000

SK2通道；JPH2蛋白；真核表達載體；HEK293

目的：構建SK2和JPH2雙基因重組真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2，并檢測其在轉染后HEK293細胞中的表達。方法：以pCMV6-entry/SK2為模板,PCR擴增出SK2片段，通過BgⅢ/Hind Ⅲ酶切位點克隆入真核表達載體pIRES-EGFP，將JPH2序列插入構建的SK2表達載體pIRES-EGFP-SK2，并通過酶切及測序鑒定。脂質體轉染法將重組質粒pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉染HEK293細胞，采用Western blot法檢測SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達。結果：構建的重組真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2經酶切和測序鑒定，證實插入的序列與GenBank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。pIRES-EGFP/SK2+JPH2質粒轉染HEK293細胞48 h后，SK2和JPH2蛋白均能成功表達。結論：成功構建了重組真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2。

小電導-鈣激活鉀通道(small conductance calcium activated potassium channel,SK channel)幾乎可表達于所有可興奮細胞[1]。SK2通道是心肌細胞的一種依賴鈣離子激活的鉀通道，在心肌細胞動作電位形成中起著重要作用[2-3]。Junctophilins(JPHs)存在于哺乳類和非哺乳類動物幾乎所有可興奮細胞，是與細胞間偶聯膜復合體(junctional membrane complex,JMC)形成有關的一類蛋白，通過錨定細胞膜與肌質網膜而維持鈣離子的穩態[4-5]。作者所在的實驗室之前的研究[6]顯示腺病毒介導的靶向小鼠JPH2 基因的siRNA可沉默小鼠心肌細胞JPH2 表達，同時也抑制細胞膜SK2 通道的功能。為進一步在體外研究JPH2蛋白與SK2通道的相互作用，該研究構建了SK2和JPH2雙基因真核表達載體，轉染哺乳動物細胞HEK293，使其能有效表達SK2通道蛋白和JPH2蛋白。

1　材料與方法

1.1材料含全長SK2 cDNA的重組克隆載體pCMV6-entry/SK2由北京傲銳東源生物科技有限公司構建。質粒pIRES-EGFP、pJPH2-pcDNA3-EGFP為實驗室庫存，HEK293細胞、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自XYGEN公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，胎牛血清和DMEM高糖培養基購自Hyclone公司，2.5 g/L胰蛋白酶購自Gibco公司，SK2兔多克隆抗體和JPH2兔多克隆抗體購自Sigma公司，5×SDS、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發光試劑購自北京康為世紀公司。

1.2SK2基因全長片段的獲得以pCMV6-entry/SK2為模板，通過PCR擴增出SK2片段，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒膠回收。

1.3真核表達載體pIRES-EGFP/SK2的構建及鑒定用BgⅢ和Hind Ⅲ雙酶切質粒pIRES-EGFP，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收質粒片段。將SK2片段通過T4 DNA連接酶連入pIRES-EGFP。轉化大腸桿菌DH5α，接種于含卡那霉素的LB平板培養基，37 ℃孵育過夜。挑選多個單克隆菌落接種于LB液體培養基，37 ℃，250 r/min振蕩過夜。次日，提取質粒用內切酶BgⅢ和Hind Ⅲ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，測序。

1.4真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2的構建將pJPH2-pcDNA3-EGFP質粒采用Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切，獲得JPH2，插入pIRES-EGFP/SK2表達載體。所得質粒經BamHⅠ單酶切，行瓊脂糖凝膠電泳并測序鑒定。

1.5重組質粒轉染HEK293細胞HEK293細胞在含體積分數10%胎牛血清的DMEM-高糖培養基中培養，37 ℃，體積分數5%CO2溫箱中孵育。待細胞融合至80%～90%時按照Lipofectamine2000操作說明書進行空質粒pIRES-EGFP以及pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉染。轉染6 h后換為含體積分數10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。轉染48 h后收集細胞。熒光顯微鏡下觀察。

2　結果

2.1真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2的鑒定構建的真核表達載體pIRES-EGFP/SK2經BgⅢ、Hind Ⅲ雙酶切后獲得的目的片段為1 700 bp，與小鼠SK2基因大小一致(圖1)；將測序結果與GenBank收錄序列(NM_080465.2)進行Blast比對，堿基序列一致。構建的真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2經BamHⅠ酶切后得到的目的片段為2 020 bp左右，與小鼠JPH2基因大小一致(圖1)；將測序結果與GenBank收錄序列(NC_000068.7)進行Blast比對，堿基序列完全一致。

M:Marker;1:pIRES-EGFP/SK2的雙酶切產物;2:pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切產物。圖1　pIRES-EGFP/SK2和pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切鑒定

2.2真核表達載體轉染HEK293細胞的結果將空質粒pIRES-EGFP及重組子pIRES-EGFP/SK2+JPH2轉染HEK293細胞48 h，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，細胞均生長良好，鋪滿培養皿底部，如圖2所示。

2.33組HEK293細胞SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達轉染pIRES-EGFP/SK2+JPH2組在60 000和74 000處可見明顯印跡條帶(圖3)，而轉染pIRES-EGFP空質粒的對照組在相應位置未見明顯條帶。

A:pIRES-EGFP;B:pIRES-EGFP/SK2+JPH2；1：明視野；2：熒光視野。圖2　真核表達載體轉染HEK293細胞48 h(×10)

1:心肌組織裂解液;2:轉染pIRES-EGFP/SK2+JPH2質粒的HEK293細胞;3:轉染pIRES-EGFP質粒的HEK293細胞。圖3　真核表達載體轉染HEK293細胞后SK2和JPH2的表達

3　討論

重組載體構建成功的標志是外源基因成功插入到載體。該研究選用的pIRES-EGFP真核表達載體有綠色熒光蛋白報告基因，能篩選轉基因的細胞，且該載體能使外源基因與EGFP同時表達，非常適合用于細胞內基因表達和蛋白質定位的研究[7]。作者首先構建pIRES-EGFP/SK2表達載體，然后將JPH2片段插入其中，最后對構建的重組質粒進行測序和酶切鑒定，測序結果顯示SK2和JPH2基因與GenBank中的序列一致，酶切結果也證實重組體內整合有目的基因，說明真核表達載體pIRES-EGFP/SK2+JPH2構建成功。該載體是一個雙基因表達載體，具有兩個MCS多克隆位點，可插入兩個基因；兩個基因之間通過IRES連接，可實現兩個基因翻譯連鎖但又獨立，避免兩個基因之間表達的融合，使兩個蛋白功能免受相互干擾。

為檢驗重組載體能否轉染真核細胞并使SK2和JPH2有效表達，作者選用HEK293細胞作為宿主細胞進行轉染，這是因為HEK293細胞是最常用的細胞株之一，具有易于培養、外源基因整合到染色體效率高、表達外源蛋白水平高、活性好等優點，利于進行實驗和結果檢測[8]。通過熒光顯微鏡觀察轉染重組質粒后的細胞，可見綠色熒光蛋白的表達，說明質粒轉染成功。Western blot結果證實轉染pIRES-EGFP/SK2+JPH2質粒的細胞中有SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表達，與已有報道[3,6]的結果一致。

在心臟疾病中，例如，肥厚型心肌病和心力衰竭，JPH2表達水平的降低能導致心肌細胞興奮收縮偶聯的缺陷[9]。然而，目前對JPH與胞漿膜離子通道偶聯的種類及分子機制所知甚少。尤其在心肌細胞上，JPH2是否與心肌SK2通道之間有偶聯作用，目前尚未見報道。

該研究成功構建了pIRES-EGFP/SK2+JPH2真核表達載體，并實現了在HEK293細胞中的有效表達，為體外進一步研究SK2通道蛋白與JPH2蛋白的相互作用打下了實驗基礎。

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[4]LANDSTROM AP,BEAVERS DL,WEHRENS XH.The junctophilin family of proteins: from bench to bedside[J].Trends Mol Med,2014,20(6):353

[5]TAKESHIMA H,HOSHIJIMA M,SONG LS.Ca2+microdomains organized by junctophilins[J]. Cell Calcium,2015, 58(4):349

[6]郭文靜,樊紅琨,鄭春光,等.沉默 JP2基因對小鼠心肌細胞 SK2通道的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,50(1):55

[7]DAI LC,XU DY,YAO X,et al.Construction of a fusion

protein expression vector MK-EGFP and its subcellular localization in different carcinoma cell lines[J].World J Gastroenterol,2006,12(47):7649

[8]PHAM PL,PERRET S,CASS B,et al.Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis[J].Biotechnol Bioeng,2005,90(3):332

[9]ZHANG HB,LI RC,XU M,et al.Ultrastructural uncoupling between T-tubules and sarcoplasmic reticulum in human heart failure[J].Cardiovasc Res,2013,98(2):269

(2015-11-19收稿責任編輯徐春燕)

Construction of an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and expressions of SK2 and JPH2 proteins in HEK293 cells

LUOTianxia1),FANHongkun1),RUIDandan1),SUNJiaxi2),MAXiaofang1),ZHANGQian1)

1)DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)SchoolofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000

SK2 channel;JPH2 protein; eukaryotic expression vector; HEK293 cell line

Aim: To construct an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and detect the expression of them in the transfected HEK293 cells.Methods: The full-length SK2 gene was obtained from a recombinant vector pCMV6-entry/SK2 by PCR amplification, and cloned it into the eukaryotic expression vector pIRES-EGFP. Then JPH2 gene was inserted into pIRES-EGFP-SK2 vector and was detected by endonuclease digestion and sequencing.The recombinant pIRES-EGFP/SK2+JPH2 was transfected into HEK293 cells with a liposome infection protocol. The expressions of SK2 and JPH2 protein were detected by Western blot.Results: Both endonuclease digestion and sequence analysis demonstrated that the inserted sequences of pIRES-EGFP/SK2+JPH2 were identical to those of the full-length of SK2 and JPH2 genes in GenBank. Moreover, both SK2 and JPH2 protein in HEK 293 cells transfected with pIRES-EGFP/SK2+JPH2 for 48 h were expressed successfully.Conclusion: The eukaryotic expression vector pIRES-EGFP/SK2+JPH2 as well as the expressions of SK2 and JPH2 cell lines have been successfully constructed.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.006

*國家自然科學基金資助項目81270248；81570311

，女，1957年10月生，博士，教授，研究方向:心臟生理學，E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

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