AZIN1慢病毒的制備及EC109穩定感染細胞株的建立*

陳競紅，常志偉，賈永旭，秦艷茹

鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

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AZIN1慢病毒的制備及EC109穩定感染細胞株的建立*

陳競紅，常志偉，賈永旭，秦艷茹#

鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

AZIN1基因；RNA編輯；慢病毒；EC109細胞

目的：制備野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立穩定感染的食管癌EC109細胞株。方法：用RT-PCR法從人食管鱗狀細胞癌組織中擴增出AZIN1基因的cDNA序列，選取測序結果中目標位點的A峰與G峰均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產物，克隆至慢病毒表達載體pLenti6/V5-D-TOPO，構建野生型和編輯型AZIN1的重組慢病毒表達載體，經酶切和測序鑒定后，經293FT細胞包裝，制備相應的慢病毒，然后感染EC109細胞株，行RT-PCR、測序和Western blot鑒定穩定感染的EC109細胞株。結果：雙酶切重組慢病毒表達載體后產生了1 347 bp和6 915 bp的片段，經測序證實1 347 bp片段為正確的AZIN1基因編碼序列；RT-PCR、測序和Western blot結果證實成功建立了穩定感染的EC109細胞株。結論：成功制備了野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立了穩定感染的EC109細胞株。

RNA編輯泛指對RNA分子在轉錄后進行再加工和修飾的過程，能使基因編碼的遺傳信息在RNA水平上進一步產生多樣性與可塑性，可能導致腫瘤特異性的“編輯/表觀遺傳突變”。研究[1]發現食管鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)中存在RNA腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA, ADAR)過表達并介導編碼抗酶抑制劑1(antizyme inhibitor 1, AZIN1)RNA(A→I)過度編輯，這種編輯型AZIN1作為一種獲得性功能表型有可能與食管鱗癌的發生發展有關。作者制備了重組野生型和編輯型AZIN1慢病毒，并建立了穩定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1的EC109細胞株，為進一步研究編輯型AZIN1在食管鱗癌中的作用機制和生物學功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料食管鱗癌組織來自河南省林州市人民醫院手術切除的組織，患者在手術前均未接受放化療，液氮保存。pLenti6/V5-D-TOPO、Lipofectamine2000轉染試劑、Trizol試劑購自Invitrogen公司；stbl3感受態細胞，慢病毒包裝載體系統(由pLP1、pLP2、pLP VSV-G三種質粒組成)，293FT細胞株及EC109細胞株由中山大學腫瘤防治中心實驗研究部保存；限制性內切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司；逆轉錄試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒(離心柱型)購自Tiangen公司；DMEM培養基、Trypsin-EDTA細胞消化液、胎牛血清購自Gibco公司；KAPA2G Fast HotStart ReadyMix(2×)購自KAPA Biosystems公司，DNA Marker購自TaKaRa公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物公司；AZIN1抗體、β-tubulin抗體購自Abcam公司。

1.2目的基因的擴增根據NCBI檢索，確定AZIN1的編碼區序列，設計引物如下。擴增AZIN1編碼序列全長的引物F1：5’-CGCGGATCCGCCAC CATGAAAGGATTTATTGATGAT-3’(含BamH Ⅰ酶切位點),R1：5’-CCGCTCGAGTTAAGCTTCAGCG GAAAAGCT-3’(含XhoⅠ酶切位點)。提取20例食管鱗癌患者癌組織的總RNA，逆轉錄獲得cDNA,以cDNA為模板用引物F1、R1進行PCR反應。反應體系為KAPA2G Fast HotStart ReadyMix(2×)25 μL,引物F1、R1各2.5 μL,cDNA 2 μL,滅菌蒸餾水18 μL。反應條件：95 ℃變性2 min；然后95 ℃ 15 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，36個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將PCR產物送至睿博興科生物技術有限公司測序，選取測序結果中目標位點的A峰與G峰(序列色譜圖中I讀為G)均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，紫外分光光度計法測定其濃度和純度。

1.3重組慢病毒表達載體的構建PCR產物回收后與pLenti6/V5-D-TOPO同時進行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，37 ℃ 30 min，瓊脂糖凝膠電泳后回收，16 ℃連接過夜。連接產物轉化stbl3感受態細胞，將已轉化的感受態細胞加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂糖培養基上，將細胞均勻涂開，將平板置于37 ℃至液體被吸收，倒置平板，37 ℃培養過夜。隨機挑選10個菌落，分別搖菌擴增后用無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，BamH Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定后送測序，挑選出1個插入片段與NCBI公布的基因編碼序列一致的重組野生型AZIN1慢病毒表達載體和1個除編輯位點為I外，插入片段其余序列與NCBI公布的基因編碼序列一致的重組編輯型AZIN1慢病毒表達載體行下一步實驗。

1.4慢病毒的包裝制備293FT細胞在293FT專用培養基中培養。A液：取空載體和慢病毒包裝載體質粒pLP1、pLP2、pLP VSV-G各5 μg加入1.5 mL Opti-MEM培養基；B液：取30 μL Lipofectamine2000加入1.5 mL Opti-MEM培養基，輕柔混合，室溫靜置5 min；將A液與B液混勻，室溫靜置20 min后加入細胞密度達80%～90%的293FT細胞培養基中，37 ℃孵育過夜后換液，轉染后48～72 h收集上清，即病毒液。野生型和編輯型AZIN1慢病毒的制備同上。

1.5穩定感染的EC109細胞株的建立EC109細胞株在含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，細胞密度達30%～40%時吸去培養基，換為病毒液培養，加入polybrene(10 mg/L)促進感染，4～8 h后更換為新鮮培養基，48 h后加入blasticidin(3 mg/L)篩選培養1周。

2　結果

2.1目的基因的擴增將PCR產物送測序，選取測序結果中目標位點的A峰與G峰均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產物(圖1)，行瓊脂糖凝膠電泳后得到目的片段大小約為1 347 bp(圖2)。

圖1　PCR擴增產物的序列色譜圖

1：DNA Marker；2：擴增產物。圖2　AZIN1編碼序列RT-PCR擴增產物

2.2重組慢病毒表達載體的鑒定重組慢病毒表達載體用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切獲得1 347 bp大小的AZIN1基因片段和6 915 bp大小的pLenti6/V5-D-TOPO開環慢病毒表達載體，與預期相符，見圖3。測序結果顯示，重組野生型AZIN1慢病毒表達載體插入片段與NCBI公布的基因編碼序列一致；重組編輯型AZIN1慢病毒表達載體插入片段除編輯位點為I外，其余序列與NCBI公布的基因編碼序列一致，見圖4。

1：DNA Marker；2～11：重組AZIN1慢病毒表達載體經BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切。圖3　重組AZIN1慢病毒表達載體的雙酶切鑒定

上：重組野生型AZIN1慢病毒表達載體；下：重組編輯型AZIN1慢病毒表達載體。圖4　重組AZIN1慢病毒表達載體的序列色譜圖

2.3穩定感染的EC109細胞株的鑒定EC109細胞本身只表達野生型AZIN1。RT-PCR結果示穩定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1慢病毒組在436 bp處的目的條帶均較深，而慢病毒對照組較淺，見圖5；測序結果見圖6；Western blot結果示穩定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1慢病毒組AZIN1蛋白表達水平均高于慢病毒對照組，見圖7。

1、5：DNA Marker；2、6：慢病毒對照組；3、7：穩定感染野生型AZIN1慢病毒組；4、8：穩定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖5　穩定感染的EC109細胞株的RT-PCR鑒定

上：慢病毒對照組；中：穩定感染野生型AZIN1慢病毒組；下：穩定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖6　穩定感染的EC109細胞株的測序結果

1、4：慢病毒對照組；2、5：穩定感染野生型AZIN1慢病毒組；3、6：穩定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖7　穩定感染的EC109細胞株的Western blot鑒定

3　討論

哺乳動物中最常見的RNA編輯類型A至I編輯是由具有雙鏈特異性的RNA腺苷脫氨酶家族的RNA編輯酶ADAR1和ADAR2催化[2]。敲除小鼠的ADAR1或者ADAR2基因可導致小鼠死亡，說明這些酶和正常的生理功能密切相關，為哺乳動物正常生長所必需[3-4]。ADARs能識別特定雙鏈RNA底物分子中的A并催化其水解脫氨成為I，從而產生新的遺傳密碼，是蛋白質分子多樣性發生的重要機制[5-8]。AZIN1轉錄物的A→I編輯受到ADAR1的特異調控，導致位于β鏈15的AZIN1 第367位殘基發生絲氨酸-甘氨酸置換，引起構象改變。在原發性肝癌中，編輯型AZIN1較野生型AZIN1具有更強的抗酶蛋白親和力，通過中和抗酶蛋白介導的鳥氨酸脫羧酶和細胞周期蛋白D1降解，促進了細胞增殖[9]。既往研究[1]對69例食管鱗癌組織及其對應的癌旁正常食管組織樣本進行RNA編輯水平檢測，發現食管鱗癌組織中AZIN1的RNA編輯水平比對應的癌旁正常食管組織升高，提示編輯型AZIN1可能在食管鱗癌的發生發展中起重要作用，編輯型AZIN1有可能是食管鱗癌診治的一個有潛力的新靶點。該實驗成功制備了野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立了穩定感染的EC109細胞株，為進一步的研究奠定了基礎。

[1]QIN YR,QIAO JJ,CHAN TH,et al.Adenosine-to-inosine RNA editing mediated by ADARs in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2014,74(3):840

[2]VALENTE L,NISHIKURA K.ADAR gene family and A-to-I RNA editing: diverse roles in posttranscriptional gene regulation[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2005,79:299

[3]HIGUCHI M,MAAS S,SINGLE FN,et al.Point mutation in an AMPA receptor gene rescues lethality in mice deficient in the RNA-editing enzyme ADAR2[J].Nature,2000,406(6791):78

[4]WANG Q,KHILLAN J,GADUE P,et al.Requirement of the RNA editing deaminase ADAR1 gene for embryonic erythropoiesis[J].Science,2000,290(5497):1765

[5]ATHANASIADIS A,RICH A,MAAS S.Widespread A-to-I RNA editing of Alu-containing mRNAs in the human transcriptome[J].PLoS Biol,2004,2(12):e391

[6]LI JB,LEVANON EY,YOON JK,et al.Genome-wide identification of human RNA editing sites by parallel DNA capturing and sequencing[J].Science,2009,324(5931):1210

[7]CHAN TH,LIN CH,QI L,et al.A disrupted RNA editing balance mediated by ADARs (Adenosine DeAminases that act on RNA) in human hepatocellular carcinoma[J].Gut,2014,63(5):832

[8]GALLO A,LOCATELLI F.ADARs: Allies or enemies? The importance of A-to-I RNA editing in human disease: from cancer to HIV-1[J].Biol Rev Camb Philos Soc,2012,87(1):95

[9]CHEN L,LI Y,LIN CH,et al.Recoding RNA editing of AZIN1 predisposes to hepatocellular carcinoma[J].Nat Med,2013,19(2):209

(2015-10-26收稿責任編輯徐春燕)

Preparation of AZIN1 lentivirus and establishment of stable infected EC109 cell strain

CHENJinghong,CHANGZhiwei,JIAYongxu,QINYanru

DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

AZIN1;RNA editing;lentivirus;EC109 cell

Aim: To prepare the lentivirus of the wild type and the edited type of AZIN1, and then establish stable infected EC109 cell strain. Methods: The cDNA came from human esophageal squamous cell carcinoma tissue was amplified by RT-PCR. The PCR products with high peak A and peak G in the target site and the gene coding sequence matching the NCBI published were chosen and inserted into lentiviral vector pLenti6/V5-D-TOPO to construct the recombinant lentiviral vectors of the wild type and the edited type of AZIN1.The recombinant lentiviral vectors were verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Then the lentivirus were packed in 293FT cells and collected to infect EC109 cells. The stable infected EC109 cell strain was identified by RT-PCR,sequencing and Western blot. Results: By restriction enzyme digestion, the recombinant lentiviral vectors were digested into fragments of 1 347 bp and 6 915 bp. DNA sequencing results showed that the 1 347 fragments were the right gene coding sequence of AZIN1.The results of RT-PCR,sequencing and Western blot showed that the stable infected EC109 cell strain was established successfully. Conclusion: The lentivirus of the wild type and the edited type of AZIN1 and the stable infected EC109 cell strain have been constructed successfully.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.001

，女，1964年1月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：消化道腫瘤基礎與臨床，E-mail:yanruqin@163.com

*國家自然科學基金資助項目81472605

R735.1