瑞格列奈二甲雙胍片微生物限度檢查方法的建立

羅遠純　雷　楊　周　霜（遵義市食品藥品檢驗所　遵義　563099）

瑞格列奈二甲雙胍片微生物限度檢查方法的建立

羅遠純雷楊周霜（遵義市食品藥品檢驗所遵義563099）

目的：建立瑞格利奈二甲雙胍片的微生物限度檢查方法。方法：本實驗用瑞格利奈二甲雙胍片三批，按《中國藥典》二部附錄xI J（107-116）（以下簡稱Ch.P2010）［1，2］所載微生物限度檢查法項下方法進行試驗。結果：稀釋劑采用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液加3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1%L-組氨酸，細菌計數采用培養基稀釋法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌計數采用常規法（1mL/皿），菌回收率可達70%以上，控制菌采用常規法（BL培養基100mL）試驗組可檢出目標菌。結論：本品供試液制備需在稀釋液中添加中和劑，細菌計數采用培養基稀釋法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌計數采用常規法（1mL/皿），大腸埃希菌檢驗采用常規法（BL培養基100mL）。

瑞格利奈二甲雙胍 方法驗證試驗 回收率 中和劑

1　儀器設備及樣品

儀器設備：DSx－280KB30型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），電熱鼓風干燥箱（上海－恒科學儀器有限公司），BHC－1300IIA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司），GHP－9126型電熱恒溫培養箱（惠科電子有限公司），SPx－150型生化培養箱（惠科電子有限公司）。

樣品：瑞格列奈二甲雙胍片（貴州聯盛藥業有限公司，批號：141102、141103、141104，規格：1mg/500mg）

2　試驗用菌種

①金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］第2代，②大腸埃希菌［CMCC（B）44102］第2代，③枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］第2代，④白色念珠菌［CMCC（F）98001］第2代，⑤黑曲霉菌［CMCC （F）98003］第2代，以上菌種均由貴州省食品藥品檢驗所提供。

3　試驗用培養基

營養瓊脂培養基（批號130116），MUG培養基（批號130905），玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號130218），膽鹽乳糖培養基（批號1301052）

營養肉湯培養基：批號121205

改良馬丁培養基：批號130121

改良馬丁瓊脂培養基：批號:1210122

以上培養基均購于北京三藥科技開發公司。

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液：批號20150610

卵磷脂（大豆）批號20150514

L-組氨酸批號20150514

帶狀皰疹是由水痘——帶狀皰疹病毒引起的以神經痛為主訴癥狀的皮膚病，全身各個部位均可發病，最好發于單側的肋間神經或頭面部三叉神經分布區。若三叉神經被皰疹病毒侵犯可出現單側的偏頭痛，呈針刺樣、刀割樣或跳痛，陣發性，多在晚上睡眠時疼痛加劇。頭痛的同時有發生部位相應區域的眼痛、牙痛或耳痛，可伴發局部的麻木、蟻行感，甚至面癱。

以上試劑均購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

4　菌液的制備

4.1種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，于30℃～35℃培養18～24h，分別取各菌種培養液1mL加至9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍依次稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至10-5、大腸埃希菌稀釋至10-6、枯草芽孢桿菌稀釋至10-6約為50～100cfu/mL，備用。

4.2接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23℃～28℃培養24～48h，取培養液1mL加入9mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍依次稀釋至10-5約為50～100cfu/mL，備用。

4.3取黑曲霉的新鮮斜面培養物，用5mL含0.05%聚山梨酯-80 的0.9%氯化鈉水溶液將孢子洗下，吸取此溶液1mL至9mL含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化鈉水溶液中，10倍依次稀釋至10-6約為50～100cfu/mL，備用。

5　供試液的制備

取本品10g，加入含3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1% L-組氨酸的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，作為1∶10的供試液。

6　細菌、霉菌及酵母菌數計數方法驗證試驗

6.1試驗組：

細菌：取1∶10供試液1mL，采用三種方法進行驗證：方法①：常規法（1mL/皿）；方法②：0.5mL/皿；方法③：0.2mL/皿。每皿加入各菌液1mL，傾注營養瓊脂培養基，每株菌分別制備平行樣，至規定時間培養。

6.2菌液組：取已稀釋好的各備用菌液1mL，傾注培養基，按規定培養，測定所加的試驗菌數，每株試驗菌平行制備2個平皿。

6.3供試品對照組：細菌：取1∶10供試液1mL：方法①：常規法（1mL/皿）。方法②：0.5mL/皿，方法③：0.2mL/皿。傾注營養瓊脂培養基，按規定條件培養，測定本底數；霉菌及酵母菌：取1∶10供試液注入兩個平皿，每皿1mL，按規定條件培養，測定本底數。

6.4稀釋劑對照組：取含3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1% L-組氨酸的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL替代供試液，加入平皿，再加入上述已稀釋好的各備用菌液1mL，分別注入培養基，立即傾注培養基，至規定溫度培養。每株試驗菌平行制備2個平皿。

6.5試驗組菌落回收率（%）=（試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數）×100%

稀釋劑對照組菌落回收率（%）＝（稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數）×100%

三種方法試驗結果見表1、表2、表3

表1　細菌和霉菌、酵母菌方法①（1mL/皿）回收率試驗結果

表2　細菌方法②（0.5mL/皿）回收率試驗結果

表3　細菌方法③（0.2mL/皿）回收率試驗結果

7　控制菌檢查方法的驗證

采用瑞格列奈二甲雙胍片三個批號分別按《中國藥典》2010版進行三次獨立平行試驗，驗證采用的方法是否可行。結果如下：

7.1供試品：取三個批號樣品1∶10供試液10mL分別接種至100mL膽鹽乳糖培養基中，置30℃～35℃培養箱中培養18～24h。取上述培養物0.2mL分別接種至5mLMUG培養基中，按上述溫度培養，分別于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察：管內培養物均不呈現熒光，MUG陰性。觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，液面均呈試劑本色，靛基質陰性。結果：三批供試品均未檢出大腸埃希菌。

7.2試驗組：取三個批號樣品1∶10供試液10mL及大腸埃希菌液規定量（相當于68cfu試驗菌）分別接種至100mL膽鹽乳糖培養基中，置35℃～37℃培養箱中培養18～24h。取上述培養物0.2mL分別接種至5mLMUG培養基中，于上述溫度培養，分別于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察：管內培養物均呈現熒光，MUG陽性；觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，液面均呈玫瑰紅色，為靛基質陽性。結果：試驗組均檢出大腸埃希菌。

7.3陰性（稀釋劑）對照：取稀釋劑10mL加入100mL膽鹽乳糖培養基中，于30℃～35℃培養箱中培養18～24h，取上述培養物0.2mL接種至5mLMUG培養基中，于上述溫度培養，分別于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察：管內培養物不呈現熒光，MUG陰性；觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，液面呈試劑本色，為靛基質陰性。結果：陰性（稀釋劑）對照未檢出大腸埃希菌。

7.4驗證標準：陰性對照及供試品不得檢出大腸埃希菌；試驗組檢出大腸埃希菌，該品種采用的大腸埃希菌檢查法通過驗證；若試驗組未檢出大腸埃希菌，應采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。

7.5試驗結果（表4～表6）：

表4　

表5　

表6　

7.6結論：取1∶10供試液10mL及大腸埃希菌規定量加入100mL膽鹽乳糖培養基中，試驗組檢出試驗菌（大腸埃希菌），供試品及陰性（稀釋劑）對照均未檢出大腸埃希菌。故可采用常規法進行大腸埃希菌檢查。

8　驗證結果分析與判斷

8.1細菌、霉菌及酵母菌數計數：采用常規法（1mL/皿），大腸埃希菌、霉菌及酵母菌回收率均大于70%，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均小于70%；采用培養基稀釋法（0.5mL/皿），枯草芽孢桿菌回收率大于70%，金黃色葡萄球菌回收率仍低于70%；采用培養基稀釋法（0.2mL/皿），金黃色葡萄球菌回收率高于70%。結論：試驗組細菌計數采用培養基稀釋法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌計數采用常規法（1mL/皿）的菌回收率均大于70%，故可照該供試液制備方法和計數法測定瑞格列奈二甲雙胍片的細菌、霉菌及酵母菌數。

8.2在控制菌三次獨立平行試驗中，采用常規法（BL100mL），供試品及陰性（稀釋劑）對照均未檢出陽性菌（大腸埃希菌），試驗組檢出陽性菌（大腸埃希菌）。結論：可采用上述供試液制備方法和大腸埃希菌檢查常規法進行瑞格列奈二甲雙胍片的大腸埃希菌檢查。參考文獻

［1］中國藥典［S］2010版二部附錄xI J，107-116.

［2］中國藥品檢驗標準操作規范P351-358.

［3］國明，祝清芬，鄭力真.無菌、微生物限度及細菌內毒素檢查方法學驗證中常見問題及分析［J］.中國藥品標準，2008，9（1）：46-49.

［4］趙麗元，張興哲，劉英慧.中和法在微生物限度檢查中的應用［J］.中國現代藥物應用，2014，8（4）：5-6.

R927

B

1672-8351（2016）02-0138-02