黃連解毒湯配方顆粒中4種成分含量的測定及與傳統湯劑的比較△

霍文杰　杜蘭哲　李　慧　官永河　趙徑華　陳向東（廣東一方制藥有限公司　佛山　528244）

黃連解毒湯配方顆粒中4種成分含量的測定及與傳統湯劑的比較△

霍文杰杜蘭哲李慧官永河趙徑華陳向東（廣東一方制藥有限公司佛山528244）

目的：建立一種同時測定黃連解毒湯配方顆粒中4種成分（梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）含量的HPLC方法，對黃連解毒湯配方顆粒和傳統湯劑的主要色譜峰及成分含量進行比較。方法：采用菲羅門Gemini 5u C18110A色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm），以乙腈為流動相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液為流動相B；梯度洗脫，體積流量為1.0mL/min，檢測波長260nm，柱溫30℃。結果：在39min內黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿4種成分完全分離；回歸方程顯示4種成分的峰面積與其濃度呈良好的線性關系；4種成分的平均加樣回收率（n=6）為95.02%～104.57%，RSD均小于3.0%；黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑的主要色譜峰的峰形峰位一致，成分含量相當。結論：該方法簡單快捷，靈敏度高，穩定、重復性好，可用于黃連解毒湯配方顆粒的質量控制，黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑的主要成分一致，可為其替代傳統湯劑作為理論依據。

黃連解毒湯 配方顆粒 高效液相色譜法 含量測定 傳統湯劑

黃連解毒湯出自唐·《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味藥材組成，為清熱解毒的經典方劑，具有清熱、瀉火、解毒功效。其中黃連、黃柏的主要有效成分為生物堿類，含有小檗堿、巴馬汀和藥根堿等；黃芩的主要成分為黃酮類，含有黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等；梔子的主要成分有梔子苷，屬環烯醚萜類。研究表明黃連解毒湯具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗內毒素、改善腦缺血和缺氧、降血糖、調血脂、降膽固醇、逆轉細菌及抑制細胞耐藥性、保護心肌、保護腸黏膜、保肝、增強免疫、抗腫瘤、鎮痛、治療神經退行性病變等多方面作用［1～8］。黃連解毒湯水提液進一步加工而成的黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿的含量較高，為主要的活性成分，因此，測定這4種成分含量對黃連解毒湯配方顆粒的質量控制具有重要的意義。目前，采用HPLC法測定黃連解毒湯中各有效成分的文獻報道較多，但多數的色譜分離效果較差或檢測時間較長，本文擬探索建立一種同時測定黃連解毒湯配方顆粒中4種主要有效成分含量的方法，并對黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑成分及含量初步比較，為臨床應用黃連解毒湯配方顆粒提供理論依據。

1　儀器與試藥

1.1儀器：Agilent高效液相色譜儀、BS110S萬分之一天平（賽多利斯）、BS200S-WEI千分之一天平（賽多利斯）、xP26百萬分之一天平（METTLER TOLEDO）、WS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2試藥：梔子苷（批號：110749-201316，含量以97.5%計）；黃芩苷（批號：110715-201318，含量以93.3%計）；鹽酸巴馬汀（批號：110732-201309，含量以86.6%計）；鹽酸小檗堿（批號：110713-201212，含量以86.7%計）均購自中國藥品生物制品檢定所；黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材均購自廣州市藥材公司，經魏梅副主任中藥師鑒定均為正品；黃連解毒湯配方顆粒，由廣東一方制藥有限公司生產；乙腈（色譜純）；水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件：色譜柱：菲羅門Gemini 5u C18110A（250mm× 4.6mm，5μm）柱；流動相：以乙腈為流動相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液為流動相B，梯度洗脫，0～25min，10%～26%A；25～34min，26%～36%A；34～39min，36%A；檢測波長：260nm；柱溫：30℃；體積流量：1mL/min；進樣量：10μL。

2.2混合對照品溶液的制備：精密稱取梔子苷對照品3.253mg、黃芩苷對照品1.949mg、鹽酸巴馬汀對照品0.345mg及鹽酸小檗堿對照品2.882mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含梔子苷126.87μg、黃芩苷72.74μg、鹽酸巴馬汀11.95μg、鹽酸小檗堿99.95μg的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液與陰性樣品溶液的制備：取黃連解毒湯配方顆粒0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液5mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

采用上述黃連解毒湯配方顆粒的制備方法分別制備缺黃芩陰性樣品、缺梔子陰性樣品和缺黃連、黃柏陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，分別制備陰性樣品溶液。

2.4醋酸-醋酸銨緩沖溶液的制備：取醋酸銨100g，加水300mL，冰醋酸7mL，搖勻，即得。

2.5專屬性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果樣品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿都能較好分離，陰性樣品無干擾，理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于5000，見圖1。

2.6線性關系考察：分別精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、12、14、16μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各色譜峰峰面積，以峰面積積分值對各成分含量進行回歸處理，求得梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿標準曲線方程及相關系數，結果見表1。

表1　四種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍

2.7精密度實驗：分別精密吸取含梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積。結果顯示四種成分峰面積的RSD分別為1.04%、0.67%、0.50%、0.62%。實驗結果表明，儀器精密度較好。

2.8穩定性實驗：取供試品溶液按“2.1”項下色譜條件，分別于0、1、2、4、8、12h進樣測定，記錄梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積。黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.92%、1.00%、1.10%、1.06%。實驗結果表明，供試品溶液在12h內穩定。

2.9重復性實驗：取黃連解毒湯配方顆粒適量，研細，取約0.3g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定樣品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量。6份黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量分別為35.97mg/g、56.72mg/g、8.96mg/g、54.24mg/g，RSD分別為 0.91%、1.03%、0.76%、0.71%，實驗結果表明，此含量測定方法重復性較好。

2.10加樣回收實驗：取已知含量的黃連解毒湯配方顆粒適量，研細，取約0.15g（含量：梔子苷35.97mg/g、黃芩苷56.72mg/g、鹽酸巴馬汀8.96mg/g、鹽酸小檗堿54.24mg/g），精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，精密加入梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對照品溶液（甲醇溶解，濃度分別為0.4523mg/mL、0.7008mg/mL、0.1086mg/mL、0.6700mg/mL）12mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果此含量測定方法回收率較好，四種成分平均回收率分別為103.42%、97.40%、98.05%、95.99%，RSD為1.49%、2.13%、0.80%、0.81%，結果見表2。

表2　黃連解毒湯配方顆粒4種成分加樣回收率結果

2.11樣品含量測定：分別制備6批黃連解毒湯顆粒劑供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采用外標法計算黃連解毒湯顆粒劑中4種成分含量，實驗結果見表3。

表3　黃連解毒湯顆粒劑中4種成分的含量測定結果（n=6）

3　黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑的比較

3.1傳統湯劑樣品的制備：按處方取藥材飲片共30g（1劑處方量），按《醫療機構中藥煎藥室管理規范》［9］操作，加10倍量水浸泡30min，加熱至沸，保持微沸30min，趁熱過濾；藥渣加8倍量水二煎，加熱至沸后，保持微沸30min，趁熱濾過，合并濾液，定容至1000mL作為傳統湯劑。

3.2黃連解毒湯配方顆粒樣品的制備：取黃連解毒湯配方顆粒7.50g（相當1劑處方量），加熱水溶解，定容至1000mL。

3.3黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑樣品色譜圖譜與含量的比較：精密吸取上述樣品溶液各5mL，精密量取25mL，蒸干，殘渣甲醇溶解，轉移至50mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，得供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，對二者的色譜圖進行比較，并對樣品液中4種成分的含量進行測定，見圖2與表4。

表4　黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑樣品的4種成分含量的比較（n=3±s）

表4　黃連解毒湯配方顆粒與傳統湯劑樣品的4種成分含量的比較（n=3±s）

樣品　梔子苷mg·mL-1黃芩苷mg·mL-1鹽酸巴馬汀mg·mL-1鹽酸小檗堿mg·mL-1傳統湯劑　1.06±0.05　1.69±0.09　0.26±0.03　1.63±0.07配方顆粒　1.01±0.06　1.57±0.13　0.34±0.08　1.76±0.11

4　討　論

本研究采用梯度法，在同一色譜條件下測定了黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿4種成分的含量，色譜圖基線平穩，4種成分能較好分離，相關峰分離度均大于1.5，在39min內4種成分能達到完全分離，大大縮短了分析時間，提高了分析效率，可用于黃連解毒湯配方顆粒有效成分含量的快速檢測。

黃連解毒湯配方顆粒主要含有環烯醚萜類、黃酮類和生物堿類3類成分。其中，梔子苷屬環烯醚萜類，極性較大；黃芩苷屬黃酮類（弱酸性），極性較小；鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿屬于生物堿類（弱堿性），常以季銨鹽的形式存在，對流動相pH的輕微變化反應極為敏感。3類成分的理化性質差別較大，很難在等度洗脫條件下實現同時分離。本研究參考有關文獻［10～12］，比較了乙腈-水流動相中不同濃度的磷酸-三乙胺、乙腈-磷酸緩沖鹽流動相中不同濃度三乙胺對黃連解毒湯配方顆粒HPLC分析的影響，結果兩種色譜系統均未能很好地將鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿分離，試驗中發現不同比例的乙腈和不同pH值的流動相對4種成分的保留時間及其相鄰峰的分離度有不同程度的影響，通過嘗試乙腈-乙酸銨緩沖鹽系統，發現在此色譜系統條件下，能夠改善生物堿類物質的峰形，減少色譜拖尾及基線漂移，能將鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿很好地分離。

本研究對黃連解毒湯配方顆粒與傳統飲片湯劑中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等主要色譜峰進行比較分析，色譜峰峰形基本相似，主要峰的保留時間相同，試驗結果表明，黃連解毒湯配方顆粒中的梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量與傳統湯劑相當，從而為黃連解毒湯配方顆粒替代傳統飲片提供了理論依據。

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Simultaneous Detection of the Contents of four Components in HuangLian Jiedu Decoction Compound granules by HPLC and compared with the traditional decoction

Huo Wenjie Du Lanzhe Li Hui Guan Yonghe Zhao Jinghua Chen xiangdong（Guangdong Yi Fang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Foshan 528244，China）

Objective：To establish a method of HPLC which can simultaneously detect the contents of four components in cluding geniposide，baicalin，palmatine，berberine in HuangLian Jiedu decoction granule，and compare the main chromatographic peaks between HuangLian Jiedu Decoction Compound granules and the traditional decoction．Methods：The samples were separated by a Phenomenex C18column（250mm×4.6mm，5μm）with a linear gradient elution under predetermined procedures．Additionally，with acetonitrile as mobile phase A，acetate-containing 1mL PH=6.0 per 100mL of water ammonium acetate buffer solution as mobile phase B，at a flow rate of 1.0mL·min-1．The column temperature was set at 30℃．The eluate was detected at the wavelength of 260nm．Results：Four active components mentioned above in HuangLian Jiedu decoction Formula Granule were completely separated within 39 minutes by the method of HPLC．The regression model suggested a sound linear correlation between the peak areas of four components and corresponding contents.And the average recovery rate（n=6）of the markers listed above ranged from 95.02%to 104.57%．All the relative standard deviations were Less than3.0%．and the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction．Conclusion：The method of HPLC was convenient and accurate to detect the contents of three active components in Bazheng decoction Formula Granule simultaneously，the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction，which is valuable for HuangLian Jiedu Decoction Compound granules to replace the traditional decoction.

Huanglianjiedu decoction Formula Granule HPLC Content detection Traditional decoction

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0010-03

佛山市科技創新專項資金項目（2013GQ100032）