酵母耐鹽相關基因HAL1在棉花中的功能表達

穆 敏，舒 娜，王 帥，郭麗雪，樊偉麗，陰祖軍，王俊娟，王德龍，葉武威

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室/農業部棉花遺傳改良重點開放實驗室，河南安陽 455000）

酵母耐鹽相關基因HAL1在棉花中的功能表達

穆 敏，舒 娜，王 帥，郭麗雪，樊偉麗，陰祖軍，王俊娟，王德龍，葉武威

（中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室/農業部棉花遺傳改良重點開放實驗室，河南安陽 455000）

【目的】克隆釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐鹽基因HAL1（halotolerance）并轉化棉花，探究該基因在棉花中的功能，進一步探究酵母耐鹽相關基因在高等植物中的具體功能。【方法】根據NCBI核酸數據庫中酵母耐鹽基因HAL1的mRNA全長序列信息，利用RT-PCR技術從釀酒酵母As2.375中克隆該基因。選擇酶切位點XbaI和SmaI對表達載體pBI121∶∶GFP進行雙酶切，采用In-Fusion技術構建pBI121-ScHAL1∶∶GFP融合表達載體。以自發熒光較弱的陸地棉品種Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉為材料，用基因槍轟擊棉花花粉進行瞬時表達研究。采用基因槍活體轉化技術將外源基因表達載體 pBI121-HAL1∶∶GFP轉化棉花鹽敏感材料中s9612，獲得T0棉花轉基因種子。用100 mmol·L-1NaCl鹽溶液對轉基因T0種子進行耐鹽性發芽試驗，并進行分子檢測，對鑒定出的轉基因植株進行葉盤耐鹽性分析。【結果】從釀酒酵母As2.375中克隆耐鹽基因ScHAL1，基因全長885 bp，共編碼294個氨基酸。對其序列進行分析，發現HAL1蛋白中絲氨酸所占比例最大，整個蛋白呈堿性且帶正電，屬于親水性蛋白。根據蛋白二級結構預測結果，推測該蛋白的結構功能域可能主要由無規則卷曲和β-折疊片構成。棉花花粉瞬時表達結果表明，轉化HAL1后，3種陸地棉花粉的綠色熒光現象都明顯增強，說明該基因可以在這3種陸地棉的花粉中表達。用100 mmol·L-1NaCl鹽溶液對轉基因棉花T0種子和受體材料中s9612自交種進行脅迫，發現轉基因種子萌發能力明顯強于受體材料，表明HAL1可以提高種子耐鹽性。根據基因核苷酸序列設計2對引物對T0轉基因棉花幼苗進行分子檢測，將純化后的PCR產物進行直接測序，測序結果證明轉基因成功。對鑒定出的轉基因植株進行葉盤耐鹽性分析發現，在600 mmol·L-1NaCl和400 mmol·L-1NaCl鹽脅迫下轉基因植株葉盤葉綠素含量均高于對照植株，且在600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，轉HAL1植株葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液處理后的葉盤。【結論】成功從釀酒酵母中克隆基因HAL1，酵母HAL1對提高棉花耐鹽性具有重要作用。

酵母；HAL1；陸地棉；花粉瞬時表達；分子檢測

0　引言

【研究意義】土壤鹽漬化已成為影響世界農業發展的一個主要因素。據報道，鹽漬化影響著全世界約1/5的耕地，并導致其以每年1 000萬公頃的速度流失［1-3］。棉花是鹽堿地的先鋒作物，是開發利用鹽漬化土地的理想作物之一，通過基因工程和轉基因技術提高棉花耐鹽性已經成為當前棉花育種的一個迫切需求和重要方向。【前人研究進展】目前，對棉花的耐鹽機制、內源基因克隆和功能分析方面做了大量的研究，已從棉花中分離克隆了許多抗逆相關基因。而在外源基因轉化棉花方面也有大量報道。郭三堆等［4］將來源于蘇云金芽孢桿菌具有高殺蟲活性的 Bt殺蟲基因GFM Cry1A導入棉花，成功培育出國產單價轉基因抗蟲棉品種，使中國成為繼美國之后世界上第二個研制成功轉基因抗蟲棉的國家；擬南芥抗旱基因AtHDG11可以提高煙草、水稻等轉基因植株的抗旱性，將其轉化陸地棉后發現該基因不僅可以提高轉基因棉花的耐旱性，同時提高棉花產量［5］；利用農桿菌介導法將山菠菜（Atriplex hortensis）AhCMO轉化泗棉3號，0.5% NaCl脅迫轉基因棉花和對照，發現轉基因棉花所受鹽害程度明顯小于非轉基因棉株，證明AhCMO可以提高轉基因棉花的耐鹽性［6］；PASAPULA等［7］將擬南芥 AVP1轉化棉花，轉基因棉花在 200 mmol·L-1NaCl條件下依然可以旺盛生長，同時在干旱條件下，轉基因植株的纖維產量至少提高了20%。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，HAL1 （halotolerance）是重要的耐鹽因子，其參與細胞內離子的濃度調節［8］。1992年，GAXIOLA等［9］和RIOS等［10］通過在高鹽條件下對轉化酵母菌株進行篩選，首次分離出HAL1并在酵母中超表達，證明其可以減少細胞內Na+積累，同時促進K+吸收。HAL1編碼一種可以調節單離子通道的水溶性蛋白（32 kD），它通過提高反饋調節中K+吸收的量來促進K+的吸收［9］。相關研究表明，在高等植物中可能存在酵母HAL1的同源基因，這意味著酵母HAL1轉化高等植物后可能與植物耐鹽性相關［11-14］。已有報道證明，ScHAL1轉化甜瓜［15］、番茄［16］、擬南芥［17］、西瓜［18］、苜蓿［19］后，轉基因植株在耐鹽性方面比野生型植株均有不同程度的提高；轉化番茄后同時提高其產量［20］；轉化水稻后提高其耐堿性［21］。【本研究切入點】ScHAL1轉化植物后可提高轉基因植物的耐鹽性，但轉化棉花的功能作用未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以釀酒酵母As2.375為材料，克隆ScHAL1并構建表達載體，運用基因槍活體轉化技術轉化陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中s9612，旨在進一步探索該基因在高等植物中的確切功能，同時為獲得棉花耐鹽性新材料奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）As2.375購自上海工業微生物研究所。

1.2RNA的提取和基因全長序列克隆

使用UltraClean Microbial RNA Isolation Kit（MO BIO）試劑盒提取釀酒酵母 As2.375的 RNA，用Nanodrop 2000核酸分析儀測定總 RNA的濃度和純度，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒將RNA反轉錄成第一鏈cDNA。用Primer Premier 5軟件設計基因全長引物，分別命名為HAL1-F和HAL1-R（表1）。以反轉錄獲得的cDNA為模板，用2×TransTaq-T PCR SuperMix擴增ScHAL1全長mRNA序列。PCR程序為94℃ 5min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40個循環；72℃ 10 min。連接pMD-18 T載體轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取陽性克隆，測序驗證。

1.3序列分析

Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析蛋白質的理化性質。ProtScale（http://web. expasy.org/protscale/）預測親疏水性。SOPMA（http:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/MPSA /npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結構。

1.4構建pBI121-ScHAL1：：GFP熒光表達載體

在線（http://bioinfo.clontech.com/infusion）設計In-Fusion引物，命名為InHAL1-F和InHAL1-R（表1）。該引物分別在基因克隆引物的上下游5′端加上載體正向酶切位點和反向酶切位點連接處15 bp的重疊堿基。以ScHAL1質粒為模板，用In-Fusion引物進行擴增。選擇的酶切位點為 XbaI和 SmaI，對表達載體pBI121::GFP進行雙酶切。采用In-Fusion連接技術進行 pBI121-ScHAL1::GFP表達載體的構建，其構建原理基本流程如圖1所示，驗證重組克隆并測序。

表1　試驗所用引物Table 1 Primers used in the experiments

1.5ScHAL1在棉花花粉中的瞬時表達分析

收集陸地棉Y-2067、ZA-23和GZ-2 3種材料的花粉，便攜式基因槍 GDS-80轟擊花粉，在激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus）下觀察花粉熒光。

1.6基因槍活體轉化棉花

提取pBI121-ScHAL1::GFP載體質粒（1 mg·mL-1）備用，金粉和質粒的處理參照孔靜靜［22］的試驗步驟；參考周凱［23］的操作方法進行基因槍活體轉化工作，即：（1）轉化的第一天下午采集花朵并計數，已去掉雄蕊的花用蠟管套住柱頭；（2）第二天上午收集花粉，將質粒和金粉的懸浮液加入基因槍中并轟擊花粉；（3）將轟擊后的花粉人工涂抹在前一天用蠟管套住的雄蕊的柱頭，并將蠟管重新套好，以免發生雜交。（4）待種子成熟，將收獲的種子做好標記，曬干后保存。

1.7轉基因棉花T0種子耐鹽性發芽試驗

采用雙夾層濾紙法［22］對收獲的 T0種子進行發芽試驗，用100 mmol·L-1NaCl溶液處理為試驗組，清水處理為對照組，放入光照培養箱中進行培養（培養條件為28℃，光照14 h；25℃，黑暗10 h），試驗組和對照組各重復3次，7 d后統計發芽結果。

1.8轉基因棉花分子檢測

根據ScHAL1在棉花基因組中的比對情況，對基因序列設計2對引物，分別命名為HAL1-F1、HAL1-R1和HAL1-F2、HAL1-R2（表1）。采用CTAB法提取轉基因植株DNA進行PCR擴增，所用程序為94℃，5 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，40 cycle；72℃ 10 min。

圖1　表達載體構建流程圖（摘自TaKaRa Clontech 技術）Fig.1 The flowing chart of construction expression vector （from TaKaRa Clontech technology）

1.9轉基因棉花葉盤耐鹽性分析

對鑒定出的轉基因植株隨機選擇6棵進行葉盤耐鹽性分析試驗。具體操作步驟參照張瑩［24］的方法，分別取6棵植株同一葉位的葉片進行打孔，滅菌水、400 和600 mmol·L-1NaCl鹽水處理，同一時期中s9612植株同葉位的葉片為對照，重復3組；28℃，光照條件培養96 h，觀察葉盤顏色和形態變化并測定每組葉綠素含量。

2　結果

2.1ScHAL1的克隆

在 NCBI數據庫中進行檢索得到 ScHAL1 （GenBank：EF015596.1）的全長序列信息，設計基因特異性引物，以cDNA為模板，擴增ScHAL1完整序列。得到一條長度為885 bp編碼294個氨基酸的核苷酸序列（圖2），測序結果正確。

圖2　ScHAL1的克隆Fig.2 Cloning of ScHAL1

2.2生物信息學分析

在線分析軟件 Protparam （http://web.expasy.org/ protparam/）的結果表明，HAL1蛋白的分子式為C1443H2269N409O460S7，分子量為32.9 kD，等電點為9.01，基因定位在細胞質中。其氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）所占比例最大，為13%；其次是賴氨酸（Lys）9%（圖3-A）。帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）有38個，帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）有31個，該蛋白呈堿性且帶正電。分析其不穩定指數為50.08，半衰期大于20 h，屬于不穩定蛋白。分析HAL1蛋白的親疏水性發現，蛋白中親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸（圖3-B），其親水性平均數（GRAVY）為-0.787，即整個蛋白為親水性。蛋白二級結構預測結果（圖3-C）表明，該蛋白中無規則卷曲的氨基酸有150個，占51.02%，組成該蛋白的主體結構；β-折疊片為73個，占24.83%；α螺旋區為39個氨基酸，占13.27% ；β-轉角占10.88%，包含32個氨基酸；推測該蛋白的結構功能域可能主要由無規則卷曲和β-折疊片構成。

2.3pBI121-ScHAL1：：GFP熒光表達載體的構建

將ScHAL1插入植物表達載體pBI121::GFP中，構建融合蛋白表達載體，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序，序列比對結果正確。選用限制性內切酶BglⅡ酶切驗證插入正確（圖4），表明表達載體構建成功，命名為 pBI121-ScHAL1:: GFP。

2.4ScHAL1在棉花花粉中的瞬時表達分析

棉花花粉具有自發熒光現象。在波長為488 nm的激發光下，棉花花粉的自發熒光為綠色。根據實驗室前期研究結果［22］，選擇花粉自發熒光較弱的3種棉花材料GZ-2、Y-2067、ZA-23收集花粉，采用基因槍活體轉化技術對棉花花粉進行轟擊，室溫下過夜培養，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖5），發現3種材料的花粉綠色熒光都明顯增強，證明該基因在棉花花粉中得到了表達，同時證明該外源基因轉化棉花的可行性，為使用基因槍活體轉化技術獲得轉基因耐鹽材料奠定基礎。

2.5轉基因棉花T0種子耐鹽性檢測

將釀酒酵母耐鹽相關基因ScHAL1轉入鹽敏感材料中s9612，共收獲T0種子187粒，同時選取材料中s9612自交種子作為對照，各取籽粒飽滿，均勻一致的種子20粒，采用雙夾層濾紙培養法，用100 mmol·L-1的NaCl溶液處理為試驗組，0 mmol·L-1處理為對照組，然后放入光照培養箱中進行培養，7 d后統計發芽結果（圖6），在NaCl溶液脅迫下，轉基因種子萌發能力明顯高于對照，表明HAL1可以明顯提高種子耐鹽性。

2.6轉基因植株的分子檢測

將正常發芽的種子置于溫室中出苗，取幼苗葉片提取DNA進行分子檢測。以載體質粒為陽性對照，中s9612自交種DNA為陰性對照（圖7）。轉基因植株和質粒中均擴出條帶，而陰性對照中無帶。將PCR產物純化后進行測序，測序結果使用DNAMAN軟件與ScHAL1的mRNA序列進行比對（圖8），認為酵母HAL1已成功轉入棉花中。

2.7葉盤耐鹽性分析結果

對分子檢測正確的9棵轉基因植株中隨機選擇6棵，進行葉盤耐鹽性試驗（圖9-A），400和600 mmol·L-1NaCl鹽水脅迫96 h后，棉花葉盤顏色逐漸變黃，葉邊緣變白，而0 mmol·L-1NaCl溶液處理下葉盤依然保持綠色；且在相同濃度鹽溶液處理下，轉HAL1植株葉盤顏色形態強于對照葉盤。對處理后的葉盤測定其葉綠素含量（圖9-B），結果發現與對照中s9612相比，0 mmol·L-1鹽溶液處理后轉基因植株葉盤的葉綠素含量較高，但差異并不明顯；400 mmol·L-1NaCl處理后，二者葉綠素含量都有所降低，轉基因植株葉綠素含量明顯高于對照；600 mmol·L-1NaCl處理后，轉基因棉花葉盤葉綠素含量高于對照一倍多。同時發現，轉基因植株葉盤在600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液處理后的葉盤，推測釀酒酵母HAL1在棉花耐受高鹽脅迫方面發揮巨大作用。

圖3　ScHAL1蛋白生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis of ScHAL1 protein

圖4　pBI121-ScHAL1：：GFP表達載體酶切驗證Fig.4 Enzyme digestion of expression vector pBI121-ScHAL1::GFP

圖5　棉花花粉的瞬時表達分析Fig.5 The transient expression analysis of cotton pollen

圖6　轉ScHAL1棉花種子發芽試驗Fig.6 Seed germination test of ScHAL1 transgenic cotton

圖7　轉基因植株分子檢測Fig.7 The transgenic plants molecular detection

圖8　測序結果Fig.8 Sequencing result

圖9　轉基因棉花葉盤耐鹽性分析Fig.9 Transgenic cotton semal salt resistance analysis

3　討論

大量的研究表明，耐鹽真菌的相關耐鹽基因能提高微生物和植物的耐鹽能力［25-26］。ZHAO等［27］將酵母超氧化物歧化酶基因SOD轉入水稻中，轉基因植株耐鹽性具有一定的提高；張麗青［28］克隆來自嗜熱毛殼菌SOD轉化煙草，除了提高轉基因植株的耐鹽能力，對煙草赤星病和炭疽病有一定的抵抗能力；謝麗霞［29］將曲霉中分離出的耐鹽基因RPS3ae和RPL44轉化擬南芥和煙草，結果表明，轉基因植株對鹽漬化的耐受型明顯高于對照野生型。

目前用于植物轉基因的方法較多，相比于農桿菌侵染法、花粉管注射和臺式基因槍轟擊法，本研究使用的基因槍活體轉化技術操作步驟簡單，減少材料污染，大大縮短試驗周期。

結合HAL1序列與GFP報告基因構建融合表達載體，通過基因槍活體轉化技術在棉花花粉中進行瞬時表達研究，結果表明，HAL1在棉花花粉中可以表達，為下一步轉化棉花獲得轉基因新材料奠定基礎。利用PCR擴增產物直接測序，縮短轉基因種子檢測的時間。而對于PCR擴增無法獲得基因全長的結果，認為可能是由于ScHAL1整合到棉花基因組后基因編碼鏈被打斷導致的，還需進一步檢測鑒定。

張荃等［30］從啤酒酵母中克隆了HAL1并利用葉圓盤法轉化番茄，對T1轉基因番茄和對照番茄進行鹽處理，15 d后觀察發現，在任何鹽濃度下，轉基因植株和對照植株的生長情況均有所緩滯，但轉基因植株的生長情況明顯優于對照。在175 mmol·L-1NaCl處理10 d后，對照番茄葉片變黃，基部葉片脫落并伴有壞死，而轉基因植株的葉片呈深綠色，生長狀況明顯強于對照。鹽脅迫下，轉基因番茄地上部分的鮮重、干重也明顯高于對照番茄。HAL1的轉入提高了轉基因番茄的耐鹽性。100 mmol·L-1NaCl溶液對轉基因種子進行耐鹽性發芽試驗，結果表明，轉基因種子在鹽脅迫下的芽長度明顯比0 mmol·L-1對照組短，但比鹽脅迫后的非轉基因種子芽長度長。對轉基因植株的葉盤耐鹽性分析表明，酵母HAL1轉化棉花后提高轉基因植株葉盤的耐鹽性，且在高鹽濃度下對其耐受性提高具有重要作用，后續試驗將對轉基因植株進行進一步研究。

4　結論

克隆釀酒酵母As2.375耐鹽基因HAL1并轉化陸地棉中s9612，在100 mmol·L-1NaCl溶液脅迫下，轉HAL1的棉花種子耐鹽性明顯強于受體材料中 s9612自交種；不同濃度鹽脅迫條件下，轉基因植株葉盤葉綠素含量均高于對照植株，且在 600 mmol·L-1NaCl溶液脅迫后，轉HAL1植株葉綠素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液的處理。證明ScHAL1可以提高棉花耐鹽性。

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（責任編輯 李莉）

The Function Expression of Salt-Tolerant Yeast Gene Halotolerance （ HAL1 ） in Cotton

MU Min，SHU Na，WANG Shuai，GUO Li-xue，FAN Wei-li，YIN Zu-jun，WANG Jun-juan，WANG De-long，YE Wu-wei
（Institute of Cotton Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology/Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement，Ministry of Agriculture，Anyang 455000，Henan）

【Objective】 The objective of this study is to clone Saccharomyces cerevisiae halotolerance （ScHAL1） gene and transformed into cotton ，explore the function of the gene in cotton，to further explore function of the salt-tolerant yeast genes in higher plants. 【Method】According to total length of mRNA sequence information of ScHAL1 in NCBI，the gene was cloned using RT-PCR technology from Saccharomyces cerevisiae As2.375，double enzyme digestion was made with XbaIand SmaIforpBI121::GFP，and pBI121-ScHAL1::GFP fusion expression vector was constructed by In-Fusion technique. With weak auto-fluorescence upland cotton varieties，Y-2067，ZA-23 and GZ-2 pollen as materials，using the gene bombarding technique to study transient expression of cotton pollen. The expression vector pBI121-ScHAL1::GFP was transformed into cotton salt-sensitive material Zhong s9612 with gene gun in vivo conversion technology，T0generation cotton genetically seeds were modified. Solution with 100 mmol·L-1NaCl was used to test the salt resistance of seeds in the transgenic T0generation seed germination experiment，molecular detection was carried out，and semal salt resistance of transgenic plants was analysis. 【Result】 ScHAL1 cloned from Saccharomyces cerevisiae As2.375 and ScHAL1 is 885 bp in length，which encoding 294 amino acids. After its sequence analysis，it was found that the largest proportion of the whole HAL1 protein is serine，and it is alkaline and positively charged and it is a hydrophilic protein. According to the results of protein secondary structure prediction，it is speculated that the structure of the protein function domain may mainly made up of random curl and beta sheet. Cotton pollen instantaneous expression results showed that after conversion of HAL1 gene，three land cotton powder green fluorescence were obviously enhanced，suggesting that the gene expressed in these three upland cotton pollen. With 100 mmol·L-1NaCl，transgenic T0generation seed germination ability obviously stronger than receptor s9612 selfing seed material，which preliminary showed that HAL1 could also improve the seed salt resistance. According to the gene nucleotide sequences，two pairs of primers were designed for molecular detection of T0generation. Direct sequencing of PCR product was conducted and the sequencing results preliminarily evidence that the transgene is successful. With the semal salt resistance analysis，it was found that the chlorophyll contents of transgenic plants in 600 mmol·L-1NaCl and 400 mmol·L-1NaCl were higher than the control，and the chlorophyll contents of transgenic plants in 600 mmol·L-1NaCl were higher than that in 400 mmol·L-1NaCl. 【Conclusion】HAL1 gene was Successfully cloned from Saccharomyces cerevisiae，yeast HAL1 gene plays an important role in improving cotton salt resistance.

yeast； HAL1； upland cotton； pollen instantaneous expression； molecular detection

2016-02-15；接受日期：2016-05-23

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX0800504B）

聯系方式：穆敏，Tel：15890348192；E-mail：15890348192@163.com。通信作者葉武威，Tel：0372-2562283；E-mail：yew158@163.com