Mdx小鼠骨骼肌中炎癥反應和mpeg1的表達

崔紅穎，　要萌萌，　宋學琴，　吳紅然，　陳雪曉，　陳秀曉，　王　雪，　宋　平

?

Mdx小鼠骨骼肌中炎癥反應和mpeg1的表達

崔紅穎1，要萌萌2，宋學琴1，吳紅然1，陳雪曉1，陳秀曉2，王雪3，宋平4

目的探討mdx小鼠不同時期骨骼肌的炎性病理改變，觀察mpeg1在mdx小鼠及對照鼠中的表達。方法選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠為實驗組，對照組為雄性C57BL/6ScSn小鼠，根據年齡分為2 w、4 w、8 w、12 w 4個亞組。通過HE染色、MGT染色、ACP染色觀察骨骼肌光鏡下的形態學改變，總結mdx小鼠骨骼肌炎性病理變化。通過RNA提取，基因芯片的檢測及mpegl的qRT-PCR檢測，觀察mpeg1的表達情況。結果常規組織染色中，2 w的mdx小鼠肌肉偶見高度濃染的肌纖維，未見肌細胞壞死，炎癥細胞浸潤，4 w可見巨噬細胞吞噬現象散在分布，8 w時炎細胞浸潤灶融合成片，12 w時炎性病灶面積減小；利用基因芯片技術篩選出mdx小鼠中有關炎癥反應的基因30余個，結果顯示與2 w相比，炎癥反應相關基因表達量均增加，在8 w時達到峰值，12 w有所下降，但較2 w時仍有升高；qRT-PCR結果顯示從4 w開始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐漸增加，8 w時含量最高。結論(1)炎癥反應參與mdx小鼠疾病的發生發展：從2 w開始出現，8 w達到高峰，12 w趨于平穩；(2)Mpeg1在mdx小鼠炎癥反應中發揮了一定的作用。

Duchenne肌營養不良；Mdx小鼠；炎癥反應；病理特點；基因芯片；Mpeg1

Duchenne型肌營養不良(duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種X連鎖隱性遺傳性疾病，為編碼dystrophin蛋白的基因發生缺失、插入和點突變，導致dystrophin蛋白的功能缺失引起肌纖維的變性和壞死[1]，在各類肌營養不良中發病率最高，約為1/3500男嬰[2]，該病起病隱襲，發病年齡偏小，且病死率高，受到廣泛關注。目前關于DMD的發病機制尚不清楚，涉及到很多常見的機制，例如鈣離子內流、炎癥細胞浸潤、促炎和促進纖維化細胞因子的激活、各種蛋白水解酶的活化、自噬的缺陷和細胞凋亡[3]等。有研究顯示局部的炎癥反應是肌肉纖維化和脂肪組織滲透的觸發點，最終導致肌細胞纖維化并由脂肪組織替代，失去功能[4]。研究證實，巨噬細胞在一般肌肉損傷所導致的炎癥反應中發揮了主要的作用[5]。巨噬細胞表達基因1(Maerophage expressed gene 1，mpeg1)是首個被發現高表達于人類和鼠科動物巨噬細胞內的基因[6]，其編碼的蛋白為穿孔素2(perforin-2)， mpegl基因在炎癥反應中起著一定的作用。mdx小鼠與DMD患者有相同的遺傳基礎，已經被廣泛用于DMD研究的各個領域[7]。在mdx小鼠疾病發展過程中，炎癥反應是否一成不變、巨噬細胞介導的炎癥反應是否參與其中是我們感興趣的。本實驗欲通過組織化學染色方法觀察mdx小鼠不同骨骼肌的炎性病理改變，利用基因芯片技術篩選與炎癥相關基因在疾病不同時期的動態表達，進一步通過qRT-PCR技術觀察mpegl在mdx小鼠及對照鼠中的表達。探討巨噬細胞相關性炎癥在mdx小鼠中的作用，為DMD提供新的治療靶點。

1　材料與方法

1.1小鼠選取雄性C57BL/10ScSn．Dmdmdx/JNju鼠(購于南京大學模式動物研究所)為實驗組，對照組為雄性C57BL/6ScSn小鼠，根據年齡分為2 w、4 w、8 w、12 w。每組各時間點選取6只，3只用于常規組織化學染色，3只用于基因芯片檢測和qRT-PCR測定。操作過程標準，符合NIH指南。

1.2肌肉標本采集實驗動物經10%水合氯醛腹腔麻醉，分別剪取股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌、肱二頭肌、心肌，取材的新鮮骨骼肌標本，用于組織切片染色的，在經液氮冷卻的異戊烷中速凍，行連續切片，設置厚度為8 μm；用于RNA提取的，在液氮中速凍后，存于超低溫冰箱待用。

1.3肌肉組織常規化學染色分別對冰凍切片行HE染色、MGT染色、ACP染色，觀察其光鏡下的形態學變化。

1.4基因芯片及qRT-PCR

1.4.1利用Triozl法提取總RNA后，制作基因芯片:(1)Qiangen Mini Kit純化總RNA;(2)cDNA的合成;(3)cRNA合成;(4)Qiangen Mini Kit純化cRNA;(5)cRNA濃度的測定;(6)cRNA樣品熒光標記;(7)Qiangen Mini Kit純化熒光標記的cRNA;(8)cRNA樣品片段化和芯片雜交;(9)芯片洗滌掃描。

1.4.2Mpeg1基因的qRT-PCR目的基因引物的合成Mpeg1、GAPDH引物序列依據文獻報道由北京賽百盛生物工程公司提供。Mpegl引物序列：上游：5’-TGA TGC GAA AGT CAC CAA CT-3’，下游：5’-CAG GTT CTT CTG CTC CAG GT-3’；GAPDH引物序列：上游：5’-ATG ACA TCA AGA AGG TGG TG-3’，下游：5’-CAT ACC AGG AAA TGA GCT TG-3’。大致操作過程為：行逆轉錄、PCR擴增。擴增時PCR反應體系(20 μl)，內含第一鏈產物 2 μl，上、下游引物各2 μl，2×Power qPCR RreMix 10 μl，ROX 0.4 μl，并用蒸餾水補至終體積。反應條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。于每個循環的第3步收集熒光信號。

2　結　果

2.1常規組織化學方法利用此方法我們觀察到2 w的mdx小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌和肱二頭肌中肌細胞大小基本一致，偶見高度濃染的肌纖維，未見肌細胞壞死，炎癥細胞浸潤；4 w可見巨噬細胞吞噬現象散在分布，偶見小灶樣分布；8 w時炎細胞浸潤灶融合成片，12 w時炎性病灶面積減?。籱dx小鼠心肌中未見到變性、壞死和炎細胞浸潤；同齡對照鼠各骨骼肌中未見上述病理改變(見圖1～圖4)。

2.2基因芯片技術對mdx小鼠股四頭肌進行mRNA測定所得結果按P<0.05、Foldchange>2.0和Foldchange<-2.0篩選出有關炎癥反應的基因數個，結果顯示與2 w相比，炎癥反應相關基因隨疾病進展表達量增加，在8 w時達到峰值，12 w有所下降，但較2 w時仍有升高，差別具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.3利用qRT-PCR技術對mpeg1基因進行定量分析結果顯示在2 w時，mdx小鼠與對照鼠之間mpeg1的含量無差別；從4 w開始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐漸增加，8 w時含量最高，與對照鼠同周齡間差別有統計學意義(P<0.05)，但mdx小鼠4 w、8 w、12 w之間表達量差別無統計學意義；而對照鼠各周齡間差別無統計學意義(見圖5)。

A～D:mdx小鼠;E～H:對照小鼠

圖1各年齡組股四頭肌HE染色(×400)

表1　各年齡組mdx小鼠中與炎癥相關的部分基因表達量的Foldchange值相互比較

基因結果按Foldchange>2.0和Foldchange<-2.0進行篩選，P<0.05

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

圖5mdx小鼠及對照鼠各年齡組股四頭肌mpeg1基因的qRT-PCR分析(★P<0.05 mdx vs C57BL/6;*P<0.05 vs mdx 2 w)

3　討　論

有研究證實，mdx小鼠病理改變開始于3 w，壞死/再生現象出現在6 w左右，并持續至12 w[8]。本實驗選取2 w、4 w、8 w、12 w雄性mdx小鼠為實驗鼠，分別取股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌、肱二頭肌和心肌進行HE、MGT、ACP等常規染色。

HE染色結果顯示2 w時上述各肌肉組織中肌細胞大小基本一致(見圖1、圖2)(部分肌肉組織圖未展示)，可見肌分裂和中央核現象，偶見高度濃染的肌纖維，又稱不透明肌纖維。不透明肌纖維被認為是肌纖維變性的一種形式，并非DMD的特異性病理表現，也可見于其他類型的肌肉損傷[9]。這說明mdx小鼠2 w時病理改變已存在。從4 w開始，可見肌纖維大小明顯不等，肌分裂現象，肌纖維變性壞死，炎癥細胞浸潤，吞噬細胞清除壞死肌纖維，肌纖維再生從壞死周邊開始。吞噬細胞中因含大量的溶酶體酶，所以ACP酶染色陽性，呈紅染色，運用ACP酶染色能夠清晰的觀察到炎性吞噬病灶的大小。在ACP染色中(見圖4)，2 w時觀察不到陽性現象;4 w時吞噬細胞散在分布，偶見小灶樣分布；8 w時散在分布的陽性細胞和小灶樣及融合成大片狀的病灶共存，炎癥反應達到高峰；12 w時大片狀陽性病灶消失，僅可見炎細胞散在或成堆分布于肌纖維間，較8 w時減弱。MGT染色可見線粒體數量較人的骨骼肌增多(見圖3)，這一現象在其他模型鼠也可觀察到，并無特異性。此外，在本實驗中，我們沒有觀察到mdx小鼠心肌細胞存在炎癥細胞的浸潤及其他病理改變，并且隨年齡增長心肌細胞變化不大(圖未展示)。mdx小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌和肱二頭肌之間，也沒有觀察到明顯不同的病理改變，這一現象與DMD患者的近端肌無力為主、肢帶肌明顯受累所不同。DMD患者壽命短暫且是致死性的，而mdx小鼠的臨床表現輕微且基本上不影響壽命，這些差異表明還有其他機制參與其中，如mdx小鼠dystrophy蛋白被功能相近的urtrophy蛋白代替所致[10]。

為了更好地理解炎癥在疾病進展中的作用，我們對炎癥反應在mdx小鼠中的動態表達進行了深入的研究。本實驗運用基因芯片技術對mdx小鼠從mRNA水平進行了動態監測，篩選出表達量變化有統計學意義的基因，其中參與炎癥反應不同方面的基因(見表1)按功能分為細胞因子及細胞因子受體、內皮細胞特異表達基因、淋巴細胞和骨髓細胞marker、趨化因子及其受體、補體系統相關基因等。它們雖然從不同方面參與炎癥反應，但整體趨勢相同，即隨著疾病進展，表達量逐漸增加，在8 w時達峰值，12 w時表達有所下降，這與我們觀察到的病理特點一致。

巨噬細胞是炎癥灶內的主要浸潤細胞。那么巨噬細胞在mdx小鼠疾病過程中有何變化？Mpeg1是首個被發現高表達于人類和鼠科動物巨噬細胞內的基因，其編碼的蛋白是穿孔素2(perforin-2)，在斑馬魚中轉入mpeg1基因后巨噬細胞系反應明顯增加，說明mpeg1特異性表達于巨噬細胞內[6]。通過對mpeg1基因的觀測，可以間接反應巨噬細胞的變化。我們的實驗證實，在mdx小鼠體內，隨疾病進展，mpeg1的表達量逐漸增加，8 w時表達量最高，12 w時下降，但仍較4 w時高，說明巨噬細胞系統與炎癥反應的變化趨勢相同。Mpeg1調節巨噬細胞在炎癥反應中的具體作用機制尚不清楚，如何抑制mpeg1的表達，減少巨噬細胞介導的炎癥反應有待于進一步研究。

[1]Koenig M,Hoffman EP,Bertelson CJ,et al.Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy(DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals[J].Cell,1987,50(3):509-517.

[2]王維治.神經病學[M].第4版.北京:人民衛生出版社,2003.292.

[3]Shin J,Marjan M,Tajrishi,et al.Wasting mechanisms in muscular dystrophy[J].Int J Biochem Cell Biol,2013,45(10):2266-2279.

[4]Cai B,Spencer MJ,Nakamura G,et al.Eosinophilia of dystrophin deficient muscle is promoted by perforin-mediated cytotoxicity by T cell effectors[J].Am J Pathol,2000,156(5):1789-1796.

[5]Radley HG,Grounds MD.Cromolyn administration (to block mast cell degranulation) reduces necrosis of dystrophic muscle in mdx mice[J].Neurobiol Dis,2006,23(2):387-397.

[6]Ryan MC,Lesley R,de ALTnas,et al.Inhibition of intracellular bacterial replication in fibroblasts is dependent on the perforin-like protein (Perforin-2) encoded by macrophage expressed gene 1[J].J Innate Immun,2013,5(2):185-194.

[7]Sara G,Simona Z,Paolo S,et al.Fibrosis and inflammation are greater in muscles of beta-sarcoglycan-null mouse than mdx mouse[J].Cell Tissue Res,2014,356(2):427-443.

[8]Baban D,Davies KE.Microarray analysis of mdx mice expressing high levels of utrophin：Therapeutic implications for dystrophin deficiency[J].Neuromuscul Disord,2008,18(3):239-247.

[9]胡靜.骨骼肌疾病臨床病理診斷[M].北京：人民衛生出版社,2011.68.

[10]Khurana TS,Watkins SC,Chafey P,et al.Immunolocalization and developmental expression of dystrophin related protein in skeletal muscle[J].Neuromuscul Disord,1991,1(3):185.

The inflammation and the expression of mpeg1 in mdx mice skeletal muscle

CUIHongying,YAOMengmeng,SONGXueqin,etal.

(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveIn this study，We hope to observe the inflammation changes in skeletal muscles of mdx mice in different periods，furthermore observe the dynamic expression of macrophage expressed gene 1.MethodsMale C57BL/1 0ScSn-Dmdmdx/JNju mice were used as the experimental group，male C57BL/6ScSn mice were used as the control group，all mice were divided according to age 2 week，4 week，8 week and 12 week.The frozen sections of muscles were stained with three routine methods，including HE staining，MGT staining and ACP staining，which were used to observe the morphological and inflammatory pathology changes.Then we extracted RNA for qRT-PCR detection of mpeg1 and gene chip testing.ResultsIn histological staining，We occasionally observed highly stain of muscle fibers in 2 w of mdx mice muscle cells，no necrosis，no inflammatory cells infiltration，We found scattered macrophage phagocytosis in muscles of age 4 w，a host of inflammatory cells integrated into groups at age 8 w，the area of inflammatory lesions was reduced at age 12 w;We screened more than 30 genes related to inflammation Using using gene chip technology，the results showed a peak at 8 w，while at 12 w declined;the qRT-PCR results showed that the expression of mpeg1 gradually increased from 4 w，and reached the highest level at 8 w.ConclusionInflammation involved in the development of the mdx mice：beginning to emerge from 2 week，peak at 8 week，stabilized at 12 week;Mpeg1 plays a certain role in the inflammatory response in mdx mice.

Duchenne muscular dystrophy;Mdx mice;Inflammation;Pathological character;Gene chip;Mpeg 1

1003-2754(2016)08-0711-04

2016-04-20；

2016-05-29

(1.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北省神經病學重點實驗室，河北 石家莊 050000；2.邢臺市人民醫院，河北 邢臺 054000；3.中國人民解放軍260醫院，河北 石家莊 050000；4.河北省人民醫院，河北 石家莊 050000)

宋學琴，E-mail：sxq5679@163.com

R746.2

A