原花青素對大鼠局灶性腦缺血損傷的腦組織TNF-α和HSP70含量的影響

徐東升，　閔鶴鳴，　包翠芬，　賈玉潔，　程　雪，　閔連秋，　胡玲玲

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原花青素對大鼠局灶性腦缺血損傷的腦組織TNF-α和HSP70含量的影響

徐東升1，閔鶴鳴2，包翠芬2，賈玉潔3，程雪3，閔連秋3，胡玲玲1

目的探討原花青素(procyanidins，PC)對局灶性腦缺血大鼠細胞凋亡和鼠腦組織TNF-α、HSP70和含量的影響。方法選用健康SD大鼠30只，雌雄各半，隨機分為假手術組、模型組、PC50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組,共5組。24 h后進行神經功能評分，并斷頭取腦，制備組織勻漿，檢測大鼠腦細胞凋亡率、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和熱休克蛋白70(HSP70)含量。結果模型組神經功能評分和大鼠腦細胞凋亡率、TNF-α高于假手術組，差異有顯著性(P<0.05)；模型組大鼠腦組織HSP70含量低于假手術組，差異有顯著性(P<0.05)。PC 50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組的神經功能評分和大鼠腦細胞凋亡率、TNF-α低于模型組，差異有顯著性(P<0.05)；HSP70含量高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。結論PC對缺血性腦損傷具有保護作用，其保護作用機制可能與其抑制鼠腦細胞凋亡，并抑制TNF-α的生成，增加HSP70的生成有關。

原花青素；腦缺血；腫瘤壞死因子-α；熱休克蛋白70；細胞凋亡

急性缺血性腦血管病目前對人類健康和生命已構成嚴重的威脅。腦急性缺血后可發生的繼發性腦損傷，導致患者病情不斷加重，并嚴重影響患者的預后。其中神經細胞凋亡和過度的炎性損傷在急性缺血性腦損傷的一系列病理生理過程中發揮著至關重要的作用。尋找一種積極治療的手段，來抑制神經細胞發生凋亡及減輕炎性損傷，成為當前治療急性缺血性卒中的重要途徑。原花青素(procyanidins，PC)廣泛存在于植物界，如山楂、葡萄、蘋果和紫薯等，是一類多酚類化合物。有研究表明，PC具有保護血管、改善循環、抑制基因突變的能力等[1～3]。PC是否具有抗炎、抑制細胞凋亡等能力，而發揮腦保護作用，有待深入研究，為新藥開發、服務臨床提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組健康SD大鼠30只，雌雄各半，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。隨機分為假手術組、模型組、PC50 mg/kg組、100 mg/kg組和200 mg/kg組,共5組，每組6只。

1.1.2藥品及試劑PC由天津尖峰天然產物研究開發有限公司提供，批號：6050804。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和熱休克蛋白70(HSP70)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3儀器JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機，上海新芝生物技術研究所；TGLL-18臺式高速冷凍離心機，太倉市醫療器械廠；DY89-Ⅰ電動玻璃勻漿機，寧波新芝科研研究所；721分光光度計，上海第三儀器廠；SHZ-88水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇醫療儀器廠；流式細胞儀，Beckmandickinson公司。

1.2方法

1.2.1給藥PC粉劑用蒸溜水制成懸浮液，術前2 w灌胃，每天一次，并于術前1 h再次灌胃可一次。

1.2.2大鼠局灶性腦缺血模型的制備以線栓法制作大鼠的大腦中動脈栓塞(MCAO)模型[4]。大鼠手術前應禁食12 h，取10%水合氯醛(3.5 ml/100 g體重)，行大鼠腹腔內注射麻醉劑，固定大鼠于手術臺，備皮，常規皮膚消毒，行頸部正中切口，然后鈍性分離皮下組織，在手術顯微鏡下逐漸暴露并分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)主干及其分叉、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，結扎并分離頸外動脈。并使用微動脈夾先暫時夾閉CCA主干近端及ICA遠端，在頸內動脈近端處備線，在ECA近CCA分叉處約3～5 mm處剪一小口，將頭端燒成光杵狀的國產尼龍繩(直徑0.235 mm，長6 cm)插入，然后將栓線輕輕插入，輕推入尼龍線尾端經ICA處入顱，若阻力感比較明顯時則停止插入，以頸總動脈分叉處計算進線深度為(18±5)mm，此時栓線已準確到達大腦前動脈的起始段，栓線將成功阻斷進入大腦中動脈的血流，引起大鼠局灶性腦缺血改變；并結扎ICA備線，取下微動脈夾；予消毒棉球常規清潔手術視野，逐層予以縫合；予青霉素鈉鹽40000 U腹腔內注射，以預防術后繼發感染。模型成功的標志是大鼠即刻出現右側horner征及對側以前肢為主的癱瘓，神經行為學評分在1～3分[4]。若大鼠無神經功能缺損癥狀則為0分；提尾向下，不能完全伸展癱瘓側前爪為1分；行走時向患側轉圈為2分；行走時易向患側傾倒，行走困難為3分；不能自發行走且伴有意識水平下降為4分；如發生大鼠死亡為5分。假手術組除不插線栓外，其他步驟同上。

1.2.3神經行為學評分采用Zea Longa 6級5分制評分標準進行神經行為學評估[4]。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率造模成功以后，共5組，每組取6只大鼠，予10%的水合氯醛(3.5 ml/100 g體重)劑量行腹腔內注射麻醉大鼠，約5 min后大鼠充分麻醉，立即予斷頭取腦，在冰上(0 ℃～4 ℃條件下)切割腦塊，取右側少量海馬組織,將缺血側腦塊在含有PBS液中研磨，研磨后組織放入離心機中離心10 min，取沉淀用PBS稀釋為10 ml，反復吹打30次，沉淀5 min，取上清1 ml，經400目尼龍網過濾兩次，制成單細胞懸液，1000 r/min離心10 min，取沉淀調細胞濃度為2×105/ml，取1 ml細胞懸液加入RNAse(1 mg/ml)37 ℃水浴箱中孵育30 min，再次離心10 min后將沉淀溶于0.4 ml PBS中，在4 ℃通光條件下進行DNA染色30 min。應用流式細胞儀離子激發光波長488 nm，選定每樣本計數10000個細胞，將所測數據和圖像輸入BDISCONSORT30計算機，應用相應程序軟件進行資料處理，計算凋亡率。

1.2.5大鼠予10%的水合氯醛麻醉，約5 min后大鼠充分麻醉，予斷頭處死后，迅速在冰上分離栓塞缺血同側海馬組織。經過充分勻漿處理后，以4 ℃環境下，15000 r/min速度離心30 min后，取出上清液，采用ELISA法，嚴格按照測定試劑盒說明書要求進行操作，測定海馬組織TNF-α和HSP70的含量。

2　結　果

2.1不同劑量PC對局灶性腦缺血大鼠神經功能評分的影響假手術組與模型組的神經功能評分比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)，表示造模成功。PC50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg劑量組的神經功能評分，與模型組的評分比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC50 mg/kg組比較，PC100 mg/kg 和200 mg/kg劑量組的神經功能評分明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC100 mg/kg組比較，PC200 mg/kg劑量組的神經功能評分明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2不同劑量PC對局灶性腦缺血大鼠海馬組織凋亡率的影響假手術組與模型組的大鼠海馬組織凋亡率比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。PC50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg劑量組的海馬組織凋亡率，與模型組的海馬組織凋亡率比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC50 mg/kg組比較，PC100 mg/kg和200 mg/kg劑量組的海馬組織凋亡率明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC100 mg/kg組比較，PC 200 mg/kg劑量組的海馬組織凋亡率明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.3不同劑量PC對局灶性腦缺血大鼠海馬組織TNF-α和HSP70的含量影響可以發現假手術組與模型組的TNF-α含量比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。PC50 mg/kg、100 mg/kg 和200 mg/kg劑量組的TNF-α含量，與模型組的TNF-α含量比較，有明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC50 mg/kg組比較，PC100 mg/kg和200 mg/kg劑量組的TNF-α含量明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC100 mg/kg組TNF-α含量比較，PC200 mg/kg劑量組的TNF-α含量明顯降低，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。也可以發現假手術組與模型組的HSP70含量比較，有明顯升高，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。PC50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg劑量組的HSP70含量，與模型組的TNF-α含量比較，有明顯升高，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC50 mg/kg組比較，PC100 mg/kg 和200 mg/kg劑量組的HSP70含量明顯升高，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)。與PC100 mg/kg組HSP70含量比較，PC 200 mg/kg劑量組的TNF-α含量明顯升高，差異顯著，有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

表1　各組大鼠經功能評分和大鼠海馬組織凋亡率的變化

與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與PC-1組比較ΔP<0.05；與PC-2組比較▽P<0.05

表2　各組大鼠海馬組織勻漿TNF-α和HSP70含量的變化

與假手術組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05；與PC-1組比較ΔP<0.05；與PC-2組比較▽P<0.05

3　討　論

當發生急性腦缺血事件后，神經細胞可發生一系列的損傷過程，包括谷氨酸毒性反應、腦細胞內Ca2+超載、自由基損傷、神經細胞能量代謝障礙等，又稱為缺血級聯反應，最終將導致神經元發生不可逆的損傷[5]。其中TNF-α是一種膜蛋白結構的活性物質，可結合相應的受體發揮一系列的生物效能作用。在發生急性腦缺血期間，機體可產生一些炎性介質如TNF-α等，可加重神經細胞損傷[6,7]。TNF-α還可以激活一些凋亡蛋白如caspase-3等，誘導神經細胞發生凋亡[8,9]。在急性腦缺血損傷過程中，炎性物質TNF-α可視為炎癥損傷反應的一個重要標志物[10]。而HSP70是機體處于某些急性應激(如局灶性腦缺血、腦外傷等)狀態下，生成的一種的生物活性蛋白質。其腦保護的機制可能為：(1)HSP70可高度維持蛋白質的穩定性，防止蛋白質發生錯構現象，及時除去衰老和變異的蛋白質，維持腦細胞的完整性[11,12];(2)HSP70可及時清除機體內產生的過多自由基，抑制炎癥介質的釋放，減輕興奮性氨基酸對神經細胞的損害;(3)HSP70有抗神經細胞的凋亡作用，如增加bcl-2的表達，減少caspase-3或caspase-9的表達；阻制c-Jun端信號通路傳導[13,14];(4)通過穩定溶酶體的質膜，對神經細胞產生保護作用[15]。

腦缺血后神經元可發生死亡，可有壞死和凋亡等兩種主要形式。而神經細胞出現凋亡，是腦缺血性損傷后的神經元發生死亡的重要形式[16]。流式細胞術(FCM)應用一種或多種分析手段，檢測細胞發生凋亡時在細胞生化、物質代謝及分子水平等一系列的表現，對待檢的凋亡細胞進行精確、快速、全面的定量分析，以此闡明不同細胞周期與細胞凋亡間復雜的關系。

PC是由一定數量的表兒茶素或兒茶素聚合而成，最簡單的是二聚體，還有三聚體、四聚體等結構，直至十聚體。有研究表明，PC具有確切的腦保護作用，主要由以下機制發揮作用：有很強的清除炎癥介質的作用；能清除氧自由基等有害物質，防止脂質過氧化反應；具有保護神經細胞的作用[17～20]；通過抑制caspase-3和(或)增加bcl-2的表達，起到抗神經細胞凋亡作用等[21]。本研究結果顯示,缺血對照組神經功能評分、腦組織凋亡率、TNF-α顯著高于假手術組，而HSP70顯著低于假手術組。經PC治療后,PC劑量組神經功能評分、腦組織凋亡率、TNF-α顯著低于缺血對照組，而HSP70顯著高于缺血對照組。這表明PC可以在一定程度上下調缺血誘導的TNF-α的表達、上調HSP70的表達，并抑制神經細胞發生凋亡，但其作用的詳細機制不甚明了，有待進一步研究。推測PC可能通過抑制促凋亡基因表達和(或)促進抑制凋亡基因表達，起到抗腦細胞凋亡的作用；通過間接或直接途徑抑制TNF-α等炎癥物質的生成，起到抗炎作用；通過間接或直接途徑促進HSP70的大量表達，起到腦保護的作用。另外，本實驗還發現PC具有劑量依賴性，即PC的劑量越高，腦保護的作用越強。

總之，PC具有較強的腦保護作用，可能與抑制TNF-α生成、促進HSP70表達等機制有關。

這就可能為腦梗死患者的嚴峻的防治工作提供新的希望，并希望能研制成新型藥物進入臨床，成為的治療腦梗死的亮點。

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Effect of procyanidins on TNF-α and HSP70 in cerebral tissue of rats with focal cerebral ischemia injury

XUDongsheng,MINHeming,BAOCuifen,etal.

(DepartmentofNeurology,ThirdAffiliatedHospitalofNantongUniversity,theThirdPeople’sHospitalofWuxicity,Wuxi214041,China)

ObjectiveTo observe the effect of procyanidins on neural cell apoptosis and the content of TNF-α,HSP70 in rat with focal cerebral ischemia.Methods30 healthy SD rats,half male and half female,were randomly divided into the sham-operative group,focal cerebral ischemia model group and procyanidins group that was subdivided into 3 groups with 50 mg/kg、100 mg/kg and 200 mg/kg procyanidins respectively.The neurological deficit score of rats was assessed and rat brain cell apoptosis rate,the content of TNF-α and HSP70 in brain tissue were measured 24 h after focal cerebral ischemia.ResultsThe neurological deficit score of sham-operative group was better than that of model group,the percentage of apopotisis cells and the content of TNF-α were lower in sham-operative group than in model group,the content of HSP70 was higher in sham-operative group than that of model group (P<0.05).The neurological deficit score were better in these procyanidins preconditioning group with 50 mg/kg,100 mg/kg and 200 mg/kg than that of model group(P<0.05).The percentage of apopotisis cells and the content of TNF-α were lower in these procyanidins preconditioning group with 50 mg/kg,100 mg/kg and 200 mg/kg than in model group,the content of HSP70 were higher in these procyanidins preconditioning group than that of model group(P<0.05).ConclusionsProcyanidins that has been given prior to the focal cerebral ischemia plays a neuroprotect role by decreasing the content of TNF-α and apopotisis,increasing the content of HSP70.

Procyanidins;Focal cerebral ischemia;Tumor necrosis factor-α;HSP70；Apopotisis

1003-2754(2016)08-0699-04

2016-04-13；

2016-08-02

國家自然科學基金項目(No.81202783)；遼寧省自然科學基金項目(No.20092192)

(南通大學附屬第三醫院，無錫市第三人民醫院神經內科，江蘇 無錫 214041；2.遼寧醫學院基礎醫學院細胞生物學教研室，遼寧 錦州 121001；3.遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 12100)

閔連秋，E-mail：minlianqiu@163.com

R743.33

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