HP-NAP對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用*

王曉東，康巧珍，王小龍，李樹芳，王　婷，劉　鑫#,汲振余

1)鄭州大學生命科學學院分子免疫學實驗室 鄭州 450001　2)河南省醫藥科學研究院 鄭州 450052

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HP-NAP對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用*

王曉東1)，康巧珍1)，王小龍1)，李樹芳1)，王婷1)，劉鑫1)#,汲振余2)#

1)鄭州大學生命科學學院分子免疫學實驗室 鄭州 4500012)河南省醫藥科學研究院 鄭州 450052

幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白；肝癌；H22細胞；IFN-γ；小鼠

目的：研究幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白(HP-NAP)對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤的生長抑制作用及可能機制。方法：構建pET28a-NAP重組質粒，轉入E.coliBL21(DE3)菌株，IPTG誘導HP-NAP的表達，Ni柱親和層析法對其進行分離純化。取BALB/c小鼠,皮下注射H22細胞(2×106個/只)構建荷瘤模型，隨機分為PBS組和HP-NAP組，以皮下瘤旁注射的方式給予PBS或HP-NAP，監測腫瘤體積和小鼠體重變化。1周后犧牲小鼠，取瘤體及各臟器稱重，以ELISA法檢測脾細胞IFN-γ分泌水平，實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中IFN-γ mRNA的表達水平。結果：利用大腸桿菌原核表達系統成功制備了HP-NAP。HP-NAP可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，對小鼠體重和臟器指數無明顯影響。與PBS組相比，HP-NAP組小鼠脾細胞IFN-γ的分泌水平及腫瘤組織中IFN-γ mRNA的表達水平均升高(P<0.05)。結論：HP-NAP可能通過上調IFN-γ的表達抑制肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。

Toll樣受體 (Toll like receptor,TLR)激動劑的抗腫瘤作用及機制已成為腫瘤治療研究的一個重要方向[1]。已有部分TLR激動劑如卡介苗、單磷酰脂質A與CpG被FDA批準為抗腫瘤臨床用藥或已進入臨床試驗階段[2-4]。幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白(Helicobacterpylorineutrophil-activating protein，HP-NAP)是幽門螺桿菌侵染胃黏膜時釋放的重要的毒力因子[5]，被證實是有效的TLR2激動劑。研究[6-7]證實，HP-NAP可通過上調Th1型免疫反應抑制膀胱癌的生長。重組溶瘤腺病毒毒株表達的分泌型HP-NAP也可通過誘導Th1型免疫極化發揮對神經內分泌瘤的治療作用[8]。該研究中，作者采用大腸桿菌表達系統表達了重組蛋白 HP-NAP,并觀察了HP-NAP對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用及其可能機制。

1　材料與方法

1.1材料H22肝癌細胞系由河南省醫藥科學研究院惠贈。6到8周齡、無特定病原體SPF級雌性BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京) 2012-0001；飼養于河南省醫藥科學研究院SPF級動物室，實驗過程中動物自由飲食飲水，光照周期為12/12 h。ProteinIsoTMNi-NTA Resin購于北京全式金生物技術有限公司， BCA蛋白定量試劑盒和RPMI 1640培養基購于北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司，IFN-γ ELISA試劑盒購于Biolegend公司(San Diego, CA, USA)，Real-time PCR引物由Invitrogen公司(Grand Island, New York, USA)合成，Trizol、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ酶及熒光定量反轉錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2pET28a-NAP重組質粒的構建、HP-NAP的誘導表達及分離純化以作者所在實驗室已有的pMAL-c2x-NAP質粒為模板進行PCR擴增，得到HP-NAP基因片段，選取BamHⅠ和XhoⅠ為酶切位點，構建pET28a-NAP重組質粒。經酶切驗證及測序后，將鑒定正確的重組質粒轉化入表達菌株E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落擴大培養至OD600 nm=0.5后，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，37 ℃培養3 h。菌體經超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清以ProteinIsoTMNi-NTA Resin進行分離純化，得到HP-NAP，以BCA法測定蛋白濃度。

1.3小鼠腫瘤模型的建立及分組處理于BALB/c小鼠左前肢腋下注射H22細胞0.2 mL(2×106個/只)，1 d后隨機分為PBS組和HP-NAP組，PBS組每只注射0.2 mL PBS， HP-NAP組注射0.15 g/L的HP-NAP 0.2 mL，1次/d， 連續7 d。

1.4觀察指標①2組小鼠給藥期間每天稱量小鼠體重并用游標卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(D)，利用公式：V=0.5×L×D2計算腫瘤體積。②小鼠體重及各臟器指數和腫瘤質量：給藥1周后犧牲小鼠，取小鼠心、肝、肺、腎以及腫瘤組織稱重，依照臟器質量(mg)/體重(g)計算臟器指數。③脾細胞IFN-γ的分泌水平測定：無菌條件下取脾臟，制備成單個脾細胞懸液，以RPMI 1640完全培養基調整細胞密度為1×107mL-1，加入48孔板(500 μL/孔)中，分別加入PBS或終濃度為3 μmol/L的HP-NAP，37 ℃、體積分數5%CO2恒溫培養箱中培養48 h后分別收集上清。ELISA法檢測IFN-γ的水平。④腫瘤組織IFN-γ mRNA表達水平的測定：取約60 mg腫瘤組織，剪碎后加入Trizol，提取總RNA，反轉錄成cDNA，利用Roche Light Cycler 480進行Real-time PCR，檢測IFN-γ mRNA的表達水平。內參β-actin(71 bp)上游引物：5’-GTGGCATCCATGAAAC TACAT-3’,下游引物：5’-GGCATAGAGCTCTT TACGG-3’；IFN-γ(92 bp)上游引物：5’-TCAAGTG GCATAGATGTGGAAGAA-3’,下游引物：5’-TG GCTCTGCAGGATTTTCATG-3’。PCR反應體系(25 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ酶12.5 μL；上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA模板2.0 μL。反應條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40個循環；60 ℃梯度升溫至95 ℃，每度保持5 s。記錄Ct值，以2-ΔΔCt法計算IFN-γ mRNA的表達水平。

1.5統計學處理采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數據，采用兩獨立樣本的t檢驗比較2組小鼠體重、腫瘤質量、臟器指數以及脾臟細胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1pET28a-NAP重組質粒的構建、HP-NAP的誘導表達及分離純化經酶切及PCR驗證(圖1A)后，進一步測序鑒定。分離純化蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，結果顯示在17 000處有目標條帶(圖1B)。

2.22組小鼠腫瘤生長狀況的比較結果見圖2。由圖2可知，HP-NAP組和PBS組小鼠均于注射H22細胞3 d后開始出現腫瘤；荷瘤后4～7 d，相對于PBS組，HP-NAP組腫瘤生長減緩。荷瘤后第8天，HP-NAP組小鼠腫瘤質量為(0.427±0.012) g，低于PBS組[(0.733±0.041) g](t=7.184,P=0.002)。

1：經BamH Ⅰ單酶切的重組質粒；2：經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的重組質粒；3：HP-NAP的PCR產物；4：菌體經超聲破碎離心后上清；5：經ProteinIsoTM Ni-NTA Resin進行分離純化后產物。圖1　重組質粒pET28a-NAP(A)及HP-NAP(B)的鑒定

圖2　2組小鼠腫瘤體積的變化

2.32組小鼠體重及臟器指數比較結果見表1。由表1可知，HP-NAP 在實驗給藥劑量(30 μg/只)下給藥1周對小鼠體重和臟器指數無明顯影響。

表1　2組小鼠體重及臟器指數比較

2.42組小鼠脾臟細胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA表達水平的比較結果見表2。由表2可知，與PBS組相比， HP-NAP組小鼠脾細胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達水平均升高。

表2　2組小鼠脾臟細胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織中IFN-γ mRNA表達水平的比較

3　討論

HP-NAP是幽門螺桿菌分泌的重要的毒力因子，被證實是有效的TLR2激動劑。由于幽門螺桿菌是一種致病菌，以其直接制備HP-NAP具有潛在的安全風險且過程復雜，得率較低[9]。作者利用大腸桿菌表達載體構建His標簽的重組HP-NAP，以親和層析法對其進行分離純化。His標簽僅在目標蛋白前添加6個組氨酸，一般認為對目標蛋白的結構和功能不產生影響，且便于使用Ni柱純化，酶切及測序結果表明成功制備了HP-NAP。進一步的研究表明HP-NAP組荷瘤小鼠腫瘤體積的增長較PBS組減緩，且HP-NAP組小鼠腫瘤質量低于PBS組，表明HP-NAP可抑制荷瘤小鼠H22腫瘤的生長。

利用TLR激動劑促進Th1細胞極化發揮抗腫瘤作用是抗腫瘤免疫治療的一種重要策略[1]。Th1型細胞能夠有效分泌Th1型細胞因子IFN-γ, IFN-γ具有多重抗腫瘤作用[10]。IFN-γ可以通過上調某些特定基因的表達來延長抗原特異性T細胞的存活并促進其增殖[11]；IFN-γ能增強樹突狀細胞的腫瘤殺傷活力[12]；IFN-γ可介導IL-12抑制腫瘤血管中血管生成因子受體3的表達，從而發揮抗腫瘤作用[13]；此外，已有研究[14]證明通過調節腫瘤微環境中IFN-γ的水平或者瘤內將IFN-γ與樹突疫苗聯用都能有效抑制腫瘤。該研究結果顯示，HP-NAP能夠有效刺激荷瘤小鼠脾細胞分泌IFN-γ且顯著提升腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達水平，提示HP-NAP可能通過刺激表達Th1型細胞因子IFN-γ發揮多重抗腫瘤作用。

總之，HP-NAP能夠抑制荷瘤小鼠H22腫瘤的生長，并顯著提升脾細胞IFN-γ的分泌及腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達水平，可作為基于上調Th1型免疫應答并發揮肝癌治療作用的潛在的免疫調節劑。

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(2015-11-27收稿責任編輯徐春燕)

Inhibitive effect of HP-NAP on tumor growth in mice bearing hepatoma H22 tumor

WANGXiaodong1)，KANGQiaozhen1)，WANGXiaolong1)，LIShufang1)，WANGTing1)，LIUXin1),JIZhenyu2)

1)LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)HenanAcademyofMedical&PharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Helicobacterpylorineutrophil-activating protein;hepatoma；H22 cell;IFN-γ;mouse

Aim: To investigate the inhibitive effect of theHelicobacterpylorineutrophil-activating protein(HP-NAP) on mice bearing hepatoma H22 tumor and the potential mechanism. Methods: The recombined plasmid pET28a-NAP was constructed and transformed intoE.coliBL21 to induce the expression of HP-NAP by IPTG, and then HP-NAP was purified using ProteinIsoTM Ni-NTA Resin. H22 hepatoma cells(2×106per mouse) were injected subcutaneously into the flank of BALB/c mice and then the mice were allocated into 2 groups and treated with HP-NAP(HP-NAP group) and PBS(PBS group), respectively. The body weight and tumor size were monitored every day. The mice were sacrificed after being treated with HP-NAP or PBS for one week.The weight of tumor and visceral organs was measured, the level of IFN-γ secreted from splenocytes was assayed by ELISA, and the mRNA expression level of IFN-γ in tumor tissue was evaluated by Real-time PCR. Results: HP-NAP was successful prepared usingE.coliexpression system. HP-NAP could significantly inhibit the tumor growth in mice bearing H22 tumor without influence of the body weight or organ indexes. HP-NAP could significantly improve the IFN-γ secretion from splenocytes and enhance the production of IFN-γ in tumor tissue(P<0.05). Conclusion: HP-NAP could inhibit the tumor growth in mice bearing H22 tumor by up-regulating the expression of IFN-γ.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.010

*國家自然科學基金資助項目U1204817，81373119，81571526；河南省教育廳基金資助項目16A180019

，劉鑫，女，1981年7月生，博士，副教授，研究方向：免疫性疾病的發病機制及治療，E-mail：liux@zzu.edu.cn；

汲振余，男，1965年8月生，博士，研究員，研究方向：腫瘤免疫學，E-mail：jizhenyu@zzu.edu.cn

R730.59