食用菌發酵液體外對白色念珠菌生長和生物被膜形成影響

竇會娟，暢靈麗，孫連海，郭文濤（漯河醫學高等專科學校 基礎醫學部，河南 漯河 462002）

食用菌發酵液體外對白色念珠菌生長和生物被膜形成影響

竇會娟，暢靈麗，孫連海，郭文濤
（漯河醫學高等專科學校 基礎醫學部，河南 漯河 462002）

該文研究食用菌液體發酵液體外對白色念珠菌（Candidaalbicans）生長及生物被膜形成的影響。采用紙片擴散法測定食用菌液體發酵液中白色念珠菌的抑菌活性；甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響。結果表明，各種食用菌發酵液對白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，其中對發酵液抑菌作用從強到弱依次為香菇發酵液、雞腿菇發酵液，抑菌圈直徑分別為（2.967±0.160）mm、（2.433±0.214）mm。對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用強弱依次為雞腿菇發酵液和香菇發酵液，其相對抑菌率分別為（39.25±1.87）%、（28.72±2.59）%。雞腿菇和香菇均對白色念珠菌在培養12 h時形成的生物被膜的抑制作用最強，相對抑菌率分別達到（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%。香菇及雞腿菇發酵液對白色念珠菌生長及其生物被膜的形成有一定的抑制作用，有進一步的開發價值。

食用菌；液體發酵；白色念珠菌；生物被膜；抑制

隨著廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫抑制劑等的廣泛應用，免疫受損人群不斷增加，條件致病真菌中念珠菌的感染率日漸升高［1-2］。白色念珠菌（Candidaalbicans）是臨床最常見的致病真菌，在機體免疫功能低下時，可引起黏膜和全身性的感染［3］。隨著抗真菌藥物的廣泛應用，白色念珠菌的耐藥現象越來越嚴重［4］。該菌對傳統抗菌藥物產生耐藥性是治療此類感染的難點。研究顯示，真菌的耐藥性與生物被膜有著密切關聯［5］。念珠菌的耐藥性與其形成生物被膜密切相關，以生物被膜狀態存在的念珠菌對抗菌藥物的敏感性要下降幾十倍甚至上千倍［6］。白色念珠菌生物被膜活性隨培養時間延長而增加，48 h后代謝活性相對穩定［7］。故本研究中對生物被膜的培養時間的選擇，確定為48 h。CHANDRA J等［8］發現白色念珠菌生物被膜的形成分為3個階段：早期（0～11 h），中期（12～30 h）和成熟期（38～72 h）。早期的黏附尤為重要，隨著培養時間的延長，生物被膜逐漸發育成熟，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物被膜感染的關鍵措施。近幾年，食用菌的抑菌作用逐漸受到研究者的關注。我國食用真菌資源豐富，而且大型食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發酵培養［9］，但食用菌液體發酵液對白色念珠菌的生長和生物被膜形成的影響，相關研究較少。

本研究采用液態發酵的方法制備金針菇（Flammulinavelutipes）、香菇（Lentinula edodes）、茶樹菇（Agrocybe aegerita）、雞腿菇（Coprinuscomaus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngi）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、木耳（Auricularia auricula）的液態發酵液。Kirby-Bauer（K-B）紙片擴散法測定發酵液對白色念珠菌的抑菌活性，甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響，為更好地解決白色念珠菌的感染和耐藥問題提供新的思路。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1用菌與指示菌

供試7種食用菌（金針菇、香菇、茶樹菇、雞腿菇、杏鮑菇、猴頭菇、木耳）：本實驗室保存菌種；白色念珠菌（Candida albicans）ATCC10231：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基及食用菌一級搖瓶液體培養基分別按照參考文獻［10-11］配制。

食用菌液體發酵培養基：蔗糖30 g，玉米粉20 g，麩皮40 g，加水至1 000m L，調節pH值為7.0。

沙氏瓊脂（Sabouraud'sagar，SDA）培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加水至蒸餾水1 000m L，調節pH值為4.0～6.0。

RPM I-1640培養基：賽齊（上海）生物工程有限公司。

1.1.3學試劑

KH2PO4（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸銨（分析純）：鄭州辰尼化學試劑廠；MgSO4·7H2O、葡萄糖（分析純）：天津市科密歐科技有限公司；甲基四氮鹽（超純級）：上海寶曼生物科技有限公司；CountessC10227自動血細胞計數儀：南京貝登生物科技有限公司。

1.2器與設備

DHZ-CA大容量恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；LRH-250-HS恒溫恒濕培養箱：廣東省醫療器械廠；DG3022A酶標儀：南京華東電子醫療裝備有限公司。

1.3法

1.3.1用菌液體發酵液的制備

參照文獻［12］中食用菌菌種活化方法和液體種子制備方法進行菌種活化和液體種子制備，然后按照香菇液體發酵產抑菌物質活性最高的發酵條件［13］，發酵液初始pH值為5，裝液量為100m L/300m L，接入7%的液體菌種，于28℃、180 r/m in搖床培養8 d，即得食用菌液體發酵液。

1.3.2同食用菌液態發酵產物抑菌活性的測定

取200μL發酵液加于制備好的6mm滅菌紙片，同時制作蒸餾水紙片作為空白對照。37℃干燥后分裝于小瓶中，-20℃保存備用。采用K-B紙片擴散法［14］，取菌懸液200μL均勻涂于SDA固體培養基。取制備好的藥敏紙片5片貼于瓊脂培養基表面，并放置空白對照紙片于正中心，25℃培養24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

發酵液抑菌圈直徑（mm）=待測發酵液抑菌圈直徑-6（滅菌紙片直徑）

1.3.3色念珠菌菌懸液的配制

將白色念珠菌接種于SDA液體培養基中，35℃搖床培養48 h，用RPM I-1640培養基稀釋，血細胞計數板計數，調整菌懸液濃度為1×106～5×106CFU/m L。

1.3.4色念珠菌生物被膜制備

以100μL/孔菌液接種于96孔細胞培養板中，37℃培養2 h后棄去RPM I-1640培養基，用pH 7.4、0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）洗3次，加入100μL RPM I-1640培養基，作為培養的零點，37℃繼續培養，每24 h更換1次培養基。

1.3.5同食用菌液體發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

在生物被膜培養的零點，加入食用菌液體發酵液100μL，空白對照孔加入200μL培養基，37℃繼續培養48 h后，棄去培養基，聚丁二酸丁二醇酯（poly butylenes succinate，PBS）洗滌3次，用XTT減低法測量各孔在波長490 nm處的OD490nm值。每組設3個重復孔，根據OD490nm值計算相對抑制率［15-16］。相對抑制率計算公式如下：

1.3.6用菌液體發酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜的影響

將100μL白色念珠菌液接種于96孔細胞培養板中，分別在生物被膜培養的0、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h時棄去培養基，加入食用菌液體發酵液100μL，空白對照組僅加入培養基，37℃繼續培養24 h。XTT法測量各孔在波長490 nm處的OD490nm值，根據OD490nm值計算相對抑制率。

1.3.7計學分析

所有數據均應用SPSS 17統計軟件進行統計處理。

2　結果與分析

2.1同食用菌發酵液對白色念珠菌的生長抑制作用

采用K-B紙片擴散法測定不同食用菌發酵液對白色念珠菌的生長抑制作用，結果如表1所示。

表1　不同食用菌發酵液對白色念珠菌的抑菌作用Table 1 Inhibition effect of diffe rent edible fungus ferm entation liquid on C.albicans

由表1可知，7種食用菌液體發酵液對白色念珠菌的生長均有不同程度的抑制作用，其中香菇、雞腿菇對白色念珠菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑分別是（2.967±0.160）mm和（2.433±0.214）mm，杏鮑菇發酵液的抑菌作用最弱，抑菌圈直徑只有（0.233±0.107）mm。

2.2同食用菌液體發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

調節發酵液初始pH值為5，在300m L三角瓶中裝入液體發酵培養100m L，接入7%的液體菌種，于28℃、180 r/min搖床培養8d，即得食用菌液體發酵液。不同食用菌液體發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響，結果如表2所示。

表2　不同食用菌液體發酵物對白色念珠菌生物被膜的影響Table 2 Effect of different edible fungus ferm entation liqu id on biofilm formation of C.albicans

由表2可知，雞腿菇發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用是最強的，相對抑制率達到了（39.25±1.87）%，香菇的抑制作用次之，相對抑制率為（28.72±2.59）%。金針菇、杏鮑菇、木耳和猴頭菇對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用不明顯。生物被膜是一種黏附于非生物或生物表面的微生物菌落，生物被膜中菌的生物學特性與浮游菌顯著不同［7］。雖然香菇發酵液對白色念珠菌的抑菌活性是最高的，但對白色念珠菌的生物被膜來說，雞腿茹發酵液的抑制作用是最強的。

2.3腿菇及香菇發酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜的影響

表3　雞腿菇及香菇液體發酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜形成的影響Tab le 3 Effec t of C.com aus and L.edodes ferm entation liqu id on biofilm formation of C.albicans at differentgrow th phases

結合食用菌發酵液對白色念珠菌的抑菌作用和對生物被膜形成的影響，選定雞腿菇、香菇發酵液為對白色念珠菌生物被膜抑制效果較好的菌種，進一步測定了其發酵液對不同生長階段生物被膜的影響，結果如表3所示。

由表3可知，隨著生物被膜形成時間的延長，雞腿菇和香菇對其抑制率增強，到12 h時，相對抑制率達到最高值，分別為（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%，隨后逐漸降低。表明雞腿菇和香菇發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的早中期有較強的抑制作用。

3　結論

本研究選取具有較強生物被膜形成功能的白色念珠菌（ATCC10231）為標準菌株，研究食用菌液體發酵液體外對白色念珠菌生長及生物被膜形成的影響。采用紙片擴散法測定食用菌液體發酵液對白色念珠菌的抑菌活性；甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響。結果表明，各種食用菌發酵液對白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，其中香菇發酵液抑菌作用最強，抑菌圈直徑為（2.967±0.160）mm；雞腿菇發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用最強，相對抑菌率為（39.25±1.87）%，香菇發酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用次之，相對抑菌率為（28.72±2.59）%。雞腿菇和香菇對白色念珠菌培養12 h時形成的生物被膜的抑制作用最強，相對抑制率分別達到（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%。對于抑制白色念珠菌感染，香菇、雞腿菇發酵液有進一步的開發價值。

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Effectofedible fungus fermentation liquid on grow th and biofilm formation of Candidaalbicans in vitro

DOU Huijuan，CHANG Lingli，SUN Lianhai，GUOWentao
（Faculty ofBasic Medicine，Luohe Medical Co llege，Luohe462002，China）

The effect of edible fungus fermentation liquid on grow th and biofilm formation of Candida albicans in vitro was researched in the paper. The bacteriostatic activity of C.albicans in fermentation liquid was determined by Kirby-Bauer，and the biofilm formation of C.albicans was determ ined by XTT reductionmethod.The resultsshowed thatallkindsof edible fungus fermentation liquid had a certain inhibiting effecton C.albicans. The bacteriostasisof Lentinus edodes fermentation liquid was the strongest，and the antibacterial circle diameterwas（2.967±0.160）mm，followed by thatof Coprinus comatus was（2.433±0.214）mm.The inhibiting effectof C.comatus fermentation liquid on biofilm formation of C.albicans was the strongest；the relative bacteriostatic ratewas（39.25±1.87）%，followed by that of L.edodes was（28.72±2.59）%.C.comatus and L.edodes had the strongest inhibitory effecton biofilm formation of C.albicans at12 h，the relative bacteriostatic rate reached to（46.37±3.14）%and（42.86±3.38）%，respectively.The fermentation liquid of C.comatus and L.edodes had a certain inhibiting effect on grow th and biofilm formation of C.albicans，which had furtherdevelopmentvalue.

edible fungus；submerged fermentation；Candidaalbicans；biofilm；inhibition

TS261．9

0254-5071（2016）01-0086-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．019

2015-11-18

河南省科技發展計劃基礎與前研科研課題（142300410430）

竇會娟（1977-），女，副教授，碩士，研究方向為微生物資源開發及微生物生態學。