ARTP誘變選育中溫α-淀粉酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化

王興吉，劉文龍，錢(qián)娟娟（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

ARTP誘變選育中溫α-淀粉酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件優(yōu)化

王興吉，劉文龍*，錢(qián)娟娟
（山東隆科特酶制劑有限公司，山東 臨沂 276400）

利用常壓室溫等離子體（ARTP）技術(shù)，對(duì)產(chǎn)中溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行誘變處理，通過(guò)平板、深孔板初篩及搖瓶復(fù)篩共篩選出3株酶活明顯提高的菌株，其中產(chǎn)酶活力最高的突變株BS-12，搖瓶酶活達(dá)到了801U/mL，較出發(fā)菌株提高了32.2%。通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到的最佳發(fā)酵條件為接種量6%，溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間68 h。在此條件下，搖瓶酶活力達(dá)到1 395U/m L，經(jīng)30 L發(fā)酵罐放大，酶活達(dá)到了1 553U/m L。

常壓室溫等離子體；中溫α-淀粉酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化；枯草芽孢桿菌

中溫α-淀粉酶是指一類(lèi)最適反應(yīng)溫度在50～70℃的α-淀粉酶，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于淀粉糖［1］、焙烤工業(yè)［2-3］、啤酒釀造［4］、酒精工業(yè)等行業(yè)，也用于飼料、紡織［5-6］、造紙［7］、醫(yī)藥［8］等各個(gè)領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)中溫α-淀粉酶的研究不多，大多數(shù)科研院所已轉(zhuǎn)向耐高溫α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶、堿性α-淀粉酶等領(lǐng)域。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)的射流溫度為25～35℃，且分布均勻，對(duì)于環(huán)境和人均無(wú)危害，無(wú)真空裝置，設(shè)備簡(jiǎn)單易于操作，與生物大分子和細(xì)胞作用明顯，同時(shí)有獨(dú)特的SOS修復(fù)機(jī)制，基于以上優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為誘變領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過(guò)ARTP誘變技術(shù)進(jìn)行誘變處理［9-10］，并對(duì)高產(chǎn)突變菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了生產(chǎn)能力和發(fā)酵水平，對(duì)促進(jìn)我國(guó)酶制劑工業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：本公司省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉、氯化鈣、瓊脂均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸出物、酵母粉、營(yíng)養(yǎng)肉湯：美國(guó)BD公司；糊精、玉米漿：青援食品有限公司；豆餅粉、玉米粉：市售。

1.1.2養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂2%，pH值自然。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，pH值6.6。

平板篩選培養(yǎng)基：葡萄糖2%，氯化鈉0.2%，酵母粉0.2%，營(yíng)養(yǎng)肉湯0.3%，蛋白胨0.5%，玉米淀粉1%，瓊脂1.3%，pH值7.0左右。

深孔板、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精4.2%，硫酸銨0.4%，磷酸氫二鈉1.5%，氯化鈣0.27%，調(diào)pH值7.0，加入碳酸鈣1%。

30 L發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉5%，玉米粉6%，豆餅粉1%，玉米漿1.4%，磷酸氫二鈉0.8%，消泡劑、液化酶適量，pH 6.5。

1.2器與設(shè)備

ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)：無(wú)錫思清源生物科技有限公司；ZWF-B3612搖瓶機(jī)、ZXSD-A 1270生化培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；Plus384酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；5810R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；30 L發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化有限公司。

1.3法

1.3.1活測(cè)定方法

酶活的測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8275—2009《食品添加劑—α-淀粉酶制劑》執(zhí)行。

酶活定義：1m L液體酶于60℃，pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為1個(gè)酶活力單位，以U/m L表示。

1.3.2菌懸液的制備

離心收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液，用生理鹽水洗滌兩次，然后用生理鹽水稀釋成濃度為106～108CFU/m L的菌懸液。

1.3.3ARTP誘變

吸取10μL菌懸液于載片中央并涂抹均勻，用無(wú)菌鑷子將載片放于ARTP系統(tǒng)操作室旋轉(zhuǎn)臺(tái)上的對(duì)應(yīng)孔位，調(diào)整照射距離2mm，氣流量10 L/min，功率100W，然后進(jìn)行誘變處理。本實(shí)驗(yàn)將出發(fā)菌株分別處理0、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s，通過(guò)菌落數(shù)計(jì)算菌株的致死率，并繪出致死率曲線(xiàn)［9］。致死率計(jì)算公式如下：

式中：m為經(jīng)ARTP處理后平板上平均菌落數(shù)，CFU；n為未經(jīng)ARTP處理平板上菌落數(shù)，CFU。

1.3.4變菌株篩選

初篩：采用平板和深孔板相結(jié)合的方法。將誘變后的菌液涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，34℃培養(yǎng)36 h，挑選淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值超過(guò)6.5的菌株；將這些菌落轉(zhuǎn)入深孔板，34℃培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液酶活［11-12］。

復(fù)篩：將初篩篩選出的誘變菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，34℃培養(yǎng)50h，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酶活。

1.3.5酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在原有發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，在裝液量100m L/500m L，搖床轉(zhuǎn)速200 r/m in的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，分別對(duì)接種量、溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

接種量的確定：采用2%、4%、6%、8%和10%的接種量，34℃發(fā)酵50 h后測(cè)定酶活，以確定最佳接種量。

溫度的確定：采取恒溫發(fā)酵的方式，以32℃、34℃、36℃、38℃、40℃作為培養(yǎng)溫度、按6%的接種量接種，發(fā)酵50 h后測(cè)定酶活，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

發(fā)酵時(shí)間的確定：按6%的接種量接種，36℃培養(yǎng)，發(fā)酵24 h后，每隔4 h測(cè)定酶活，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.6優(yōu)條件下的搖瓶實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.5的試驗(yàn)結(jié)果，選取最優(yōu)發(fā)酵條件，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束測(cè)定酶活。

1.3.730 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)化后發(fā)酵條件效果，采用30 L發(fā)酵罐對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。固定裝液量60%，接種量6%，溫度36℃，罐壓0.06MPa，通氣量3m3/h，發(fā)酵時(shí)間68 h。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定酶活力。

1.3.8變菌株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

誘變株在平板上進(jìn)行6次傳代培養(yǎng)，對(duì)每1代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定酶活力，以檢測(cè)誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性［13-15］。

2　結(jié)果與分析

2.1變菌株的篩選結(jié)果

2.1.1ARTP誘變致死率曲線(xiàn)的測(cè)定

按方法1.3.3對(duì)出發(fā)菌株誘變致死率進(jìn)行計(jì)算，并獲得致死率曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1　枯草芽孢桿菌的ARTP致死率曲線(xiàn)Fig.1 Fatality ra te curve of Bacillus subtilis with the ARTP treatm ent

由圖1可知，隨著誘變時(shí)間的增加，致死率不斷上升。當(dāng)誘變時(shí)間為15 s時(shí)，致死率＞90%，而時(shí)間達(dá)到20 s時(shí)，致死率＞99%，本實(shí)驗(yàn)將致死率設(shè)定為90%以上即可，故誘變處理時(shí)間確定為15 s。

2.1.2變菌株初篩

共挑選出1 600個(gè)淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值超過(guò)6.5的菌落。通過(guò)深孔板篩選出酶活提高15%以上的誘變菌株共36株。

2.1.3變菌株復(fù)篩

將初篩篩選出的誘變菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定其酶活力，搖瓶發(fā)酵后酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株BS-12的發(fā)酵水平最高，所以選用BS-12進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　菌株復(fù)篩結(jié)果Tab le 1 Secondary screening results of the m utan t strains

2.2酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1種量對(duì)酶活力的影響

接種量對(duì)菌株發(fā)酵酶活力的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，接種量＜6%時(shí)，酶活力隨接種量的增大而增高，接種量＞6%時(shí)，酶活力隨接種量的增大反而降低，當(dāng)接種量為6%時(shí)，酶活力最高。接種量的多少主要影響菌體的生長(zhǎng)速度和代謝強(qiáng)度，接種量小，延遲期長(zhǎng)，不利于菌體快速大量繁殖；接種量大，菌體過(guò)早衰老，產(chǎn)酶期短，最終活力不高。故選擇接種量為6%。

圖2　接種量對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effectof inoculum onα-am ylase activity

2.2.2度對(duì)酶活力的影響

溫度對(duì)菌株發(fā)酵酶活力的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，溫度對(duì)發(fā)酵活力有較大影響，溫度低于36℃，菌體生長(zhǎng)緩慢，不易形成高密度發(fā)酵；溫度高于36℃，菌體生長(zhǎng)快，自溶也快，發(fā)酵活力反而降低。溫度36℃時(shí)，酶活力最高，為1 050 U/m L，因此最佳培養(yǎng)溫度為36℃。

圖3　溫度對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig.3 Effecto f tem perature onα-am ylase activity

2.2.3酵時(shí)間對(duì)酶活力的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，24 h以后發(fā)酵液酶活力逐漸升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在發(fā)酵68 h時(shí)酶活力達(dá)到最高，68 h以后酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，故選擇發(fā)酵時(shí)間為68 h。

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-淀粉酶活力的影響Fig.4 Effectof different fermentation time onα-am ylase activity

2.2.4優(yōu)條件下的搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，3批搖瓶培養(yǎng)，酶活力分別為1 383 U/m L、1 416 U/m L、1 395 U/m L，平均酶活達(dá)到1 395U/m L，較優(yōu)化前提高了74.2%。

2.330 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)條件下采用30 L發(fā)酵罐對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，3批放大實(shí)驗(yàn)的酶活力分別為1 523U/m L、1 561U/m L、1 576 U/m L，平均酶活達(dá)到1 553U/m L，因此優(yōu)化的發(fā)酵條件是可行的。

2.4變菌株的遺傳穩(wěn)定性

誘變株BS-12在平板上進(jìn)行6次傳代培養(yǎng)，對(duì)每1代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2　BS-12遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 Genetic stability experiments resultof strain BS-12

由表2可知，經(jīng)ARTP誘變的BS-12菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)6次傳代后，搖瓶發(fā)酵活力都維持在1300U/m L左右。

3　結(jié)論

對(duì)ARTP誘變處理的枯草芽孢桿菌進(jìn)行篩選，獲取高產(chǎn)中溫α-淀粉酶的突變株BS-12，搖瓶酶活達(dá)到了801U/m L，較出發(fā)菌株提高了32.2%。該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，6次傳代后搖瓶發(fā)酵活力維持在1 300U/m L左右。

對(duì)誘變菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定的最佳發(fā)酵條件為接種量6%，溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間68 h。在此條件下，搖瓶酶活力達(dá)到1 395U/m L，經(jīng)30 L發(fā)酵罐放大，酶活達(dá)到了1 553 U/m L。

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Screening of medium-temperature α-amylase high-yield strains by ARTP and its fementation conditions optimization

WANG X ingji，LIUWenlong*，QIAN Juanjuan
（Shandong Long Kete Enzyme Co.，Ltd.，Linyi276400，China）

The Bacillus subtilis strainswhich producemedium-temperature α-amylase weremutated by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）mutagenesis.Three strains which had higherα-am ylase activity were screened through plate and deep hole plate screening and flask secondary screening.Thestrain BS-12 had the highestenzyme-producing activity of 801 U/m l，which was32.2%higher than thatof the original strain. A ftersingle factorexperiment，theoptimal fermentation conditionswereas follows:inoculum 6%，fermentation temperature 37℃and time 68 h.Under the condition，the enzyme activitywas1 395 U/m l in flask.However，the experimentwas scaled-up by 30 L fermentation tank，and the enzyme activity reached 1 553 U/m l.

atmospheric and room temperatureplasma；medium-temperatureα-amylase；fermentation conditions；optim ization；Bacillus subtilis

TQ925

0254-5071（2016）01-0078-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．017

2015-10-27

王興吉（1970-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槊钢苿┥a(chǎn)與開(kāi)發(fā)。

劉文龍（1982-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槊钢苿┥a(chǎn)與開(kāi)發(fā)。