糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發酵的影響

于志強，伍時華，趙東玲，黃翠姬，易　弋（廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006）

糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發酵的影響

于志強，伍時華，趙東玲*，黃翠姬，易弋
（廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006）

研究了不同質量濃度糠醛對釀酒酵母GGSF16葡萄糖酒精發酵的影響，旨在為木質纖維素水解液酒精發酵提供參考和依據。以酵母浸出粉胨葡萄糖培養基替代木質纖維素水解液，調節糠醛質量濃度為0～2 g/L之間七個不同梯度，基于曲線下面積法考察糠醛對葡萄糖酒精發酵的影響。結果表明，隨著糠醛質量濃度的增加酒精發酵周期延長，乙醇產率逐漸降低，但最終酒精度并沒有明顯差別；當糠醛質量濃度為0時乙醇產率最高，為3.24 g/（L·h）；發酵周期最短，為6.94 h。

糠醛；葡萄糖；酒精發酵；酵母；曲線下面積

木質纖維素主要包含單糖聚合而成的纖維素和半纖維素。半纖維素的主要降解產物為木糖，在高溫或高壓條件下木糖將進一步降解為糠醛，糠醛為木質纖維素水解液酒精發酵的主要抑制劑［1-2］。而糠醛抑制酵母代謝的機理并不完全清楚，但已有研究表明，糠醛抑制了糖酵解過程中主要的酶的活性，包括己糖激酶、磷酸果糖激酶和磷酸丙糖脫氫酶［3］。此外，三羧酸循環及乙醇合成路徑中的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶同樣受糠醛的影響［4］。在厭氧條件下，酵母利用糠醛轉變成糠醇和甲酸［5］。這種轉換最可能的途徑是糠醛取代乙醛作為乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的底物［6］。糠醛的抑制效果主要與酵母代謝利用糠醛的能力有關［6］。如果糠醛對酒精發酵的影響能夠確定，便可通過特定的去毒方法、選擇合適的菌種或者應用最優的工藝條件來提高發酵效率。

為了避免水解液中的其他成分對發酵產生影響或與糠醛產生相互作用，故將糠醛貯備液添加到酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）中替代木質纖維素水解液進行酒精發酵，通過曲線下面積法（areaunder the curve，AUC）并對糖代謝曲線擬合［7-10］，考察酒精發酵過程中的葡萄糖代謝、細胞生長及乙醇的生成受糠醛的抑制效果，從而為利用木質纖維素水解液酒精發酵奠定基礎。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1株

釀酒酵母GGSF16（Saccharomycescerevisiae GGSF16）：由廣西科技大學發酵工程研究所提供。

1.1.2養基

斜面活化培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH值。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH值。

YEPD發酵培養基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH值。

以上培養基和溶液均115℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2器與設備

ZWYD-2402疊式恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司；UV-1100紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SBA-40生物傳感儀：山東科學院生物研究所；SW-CJ-TB標準凈化工作臺：蘇州集團蘇州安泰空氣技術有限公司；M ikro220R臺式冷凍離心機：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司。

1.3法

1.3.1酵方法

種子培養：將實驗室保存的斜面菌種接至斜面活化培養基中，32℃條件下培養1～2 d，待其斜面上長出白色菌苔即為菌種培養成熟。將活化的菌種轉接至種子培養基中，32℃、160 r/min培養24 h后，經12 000 r/min離心5min，棄上清液，加入無菌水將酵母泥制成10倍濃縮種子懸液備用。

發酵流程：以10%的接種量（2m L高濃度種子液）將種子液轉接至200m L YEPD發酵培養基中（500m L的錐形瓶），無菌操作將糠醛貯備液加入YEPD發酵培養基中，分別制成0、0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L質量濃度梯度，并以不添加糠醛作為對照組。初始酵母數在3.32×107CFU/m L左右，搖床160 r/m in，溫度為32℃，發酵條件為非嚴格厭氧，用透氣膜和牛皮紙包扎發酵。每個處理3個平行。發酵過程中每隔2 h取樣并取其中一個平行用稱重法測CO2質量損失，直至CO2質量損失＜0.2 g時，即發酵結束。

1.3.2析方法

樣品處理：取發酵液1m L，12 000 r/min離心5min，取上清液于-60℃冰箱冷凍，用于葡萄糖含量和乙醇生成數據分析；加入與抽取上清液等量的蒸餾水混合成菌懸液，用于測定酵母細胞OD值。

生物量的測定：使用UV-1100紫外可見分光光度計，將菌懸液稀釋至合適倍數測定其在波長600 nm處的吸光度值。酒精度與葡萄糖含量采用SBA-40C生物傳感分析儀測定，標準乙醇與葡萄糖含量分別為0.1%vol和1 g/L，將發酵上清液稀釋合適倍數進樣分析。

1.3.3線下面積與糖代謝曲線擬合

葡萄糖的代謝曲線及細胞OD值的生長曲線運用GraphPad Prism 5軟件進行處理，并分別獲得葡萄糖代謝曲線下面積及細胞生長曲線下面積，分別記做葡萄糖AUC與OD值AUC。

葡萄糖的代謝曲線運用Origin 8.0軟件進行非線性曲線擬合，葡萄糖代謝方程擬合較好的主要有Boltzm ann S形函數和DoseResp S形函數，選擇R2最大的函數作為其擬合方程，并以擬合方程分別計算出葡萄糖消耗一半與完全消耗的時間，記做t50與tend。

1.3.4定方法

2　結果和分析

2.1醛對糖代謝的影響

2.1.1醛對葡萄糖AUC的影響

圖1　不同糠醛質量濃度條件下酵母GGSF16葡萄糖消耗擬合曲線Fig.1 Fitting curve of glucose consum ption from S.cerevisiae GGSF16 w ith differen t furfural concentration

表1　糠醛濃度對酵母GGSF16葡萄糖代謝曲線面積的影響Table 1 Effec t of different furfural concentration on glucose m etabolism curve area from S.cerevisiae GGSF16

曲線下面積法能夠直觀、準確且定量的判斷葡萄糖的利用情況，從而整體的評估發酵的好壞［10］。葡萄糖AUC越大說明葡萄糖利用速率越慢、糠醛對酵母細胞利用葡萄糖的抑制作用越強，反之亦然［10］。從圖1可知，隨著糠醛質量濃度的增大，葡萄糖的代謝速率不斷降低，但對最終的殘糖量影響不大。由表1可知，對照組的葡萄糖AUC值最小193.10±2.16，不同糠醛質量濃度條件下的葡萄糖AUC隨糠醛質量濃度的增大而增大。當糠醛質量濃度為2.0 g/L時，葡萄糖AUC達到最大355.70±2.93。分別以不同糠醛質量濃度條件下的葡萄糖AUC與對照組的葡萄糖AUC比值發現，比值隨著糠醛質量濃度的增大而增大。結果表明，抑制作用隨著糠醛質量濃度的增大而不斷增強［3-7］。當糠醛質量濃度分別為0.25 g/L與1.0g/L時，比值分別為1.04±0.008 7和1.31±0.004 1，表明糠醛質量濃度為0.25 g/L時，對酵母GGSF16利用葡萄糖的影響較小，而當糠醛質量濃度＞1.0 g/L時，對葡萄糖的消耗具有明顯影響［11］。

2.1.2醛對t50和tend的影響

圖2　不同糠醛質量濃度條件下t50和tend值Fig.2 t50and tendw ith different furfural concentrations

應用Origin 8.0軟件對圖1糖代謝曲線的擬合，可以分別計算出葡萄糖消耗一半和完全消耗的時間t50與tend。t50可以判斷酒精發酵前期葡萄糖的消耗情況，tend則可以預測酒精發酵的結束時間［7］，從而直觀、定量的比較出不同濃度糠醛對酒精發酵結束時間的影響，結果見圖2。由圖2可知，t50和tend均隨糠醛濃度的增大而增大。當糠醛質量濃度＜0.5 g/L時，t50變化并不顯著。表明糠醛在低濃度條件下對酵母GGSF16利用葡萄糖的影響較小，可能由于酵母本身對糠醛具有一定的耐受性［12］。當糠醛質量濃度＞1.0 g/L時，t50與tend均隨糠醛濃度增大而增大，tend與對照組相比分別增加了35.50%、43.15%和55.07%（見圖2）。結果表明，隨著糠醛濃度的增加，酒精發酵周期逐漸延長。

圖3　不同糠醛質量濃度條件下酵母GGSF16細胞生長曲線Fig.3 Cellgrow th curve of S.cerevisiae GGSF16 a t different furfural concentrations

2.2醛對細胞生長的影響

測定細胞懸液的OD值能夠簡單、快速地評估微生物的生長情況［12］。與平板計數法相比更加適用、快速且廉價，因此一些作者已經采用OD值曲線下面積法來評估不同物質對細胞生長的抑制作用［13-16］。OD值AUC能夠簡單、直觀且定量的比較細胞生長的情況［11］。OD值AUC越小則說明抑制成分對微生物生長抑制越明顯，反之亦然［14］。由圖3可知，隨著糠醛濃度的增大，發酵前期細胞的生長速率逐漸降低，細胞的生長出現停滯且最終OD值逐漸減小。糠醛的存在抑制了乙醇脫氫酶的活性，乙醇脫氫酶有助于細胞排除乙醛，從而引起乙醛在細胞內部的積累，乙醛在細胞內部的積累被認為是細胞生長放緩或停滯的原因［17］。而在高濃度糠醛條件下會造成細胞的死亡可能是最終OD值隨糠醛濃度的增大而減小的原因［18］。當糠醛質量濃度為2.0 g/L時，0～4 h的OD值增長量為0.49，而對照組在0～4 h的OD值增長量則為6.54。充分說明糠醛影響了細胞的繁殖與再生，且這種影響隨著糠醛濃度的增大而增強。實驗結果表明，糠醛在高濃度條件下，嚴重阻礙了細胞的生長。因此，高接種量可能是降低糠醛抑制作用的一種有效途徑。由表2可知，不同糠醛濃度條件下的OD值AUC隨糠醛濃度的增加而減小，糠醛濃度為0時，OD值AUC最大132.00±1.48。糠醛質量濃度為2 g/L時，OD值AUC最小75.58±0.83。說明糠醛濃度越高對細胞生長的抑制作用越強。糠醛的添加組與對照組的比值同樣隨糠醛濃度的增加而減小，當糠醛質量濃度為0.25 g/L和1.0 g/L時，比值分別為0.96與0.81，當糠醛質量濃度為0.25 g/L時，對細胞生長的影響較小，而當糠醛質量濃度＞1.0 g/L時，細胞生長則明顯放緩，表明糠醛阻礙了細胞的繁殖與再生，從而引起細胞生長的停滯［18］。與糠醛對葡萄糖代謝的影響一致，糠醛在低濃度條件下對細胞生長的影響較小；當糠醛質量濃度＞1.0 g/L時，則對細胞生長具有明顯影響。

表2　糠醛質量濃度對酵母GGSF16細胞生長曲線下面積的影響Table 2 Effectof different furfural concentration on area under the curve of S.cerevisiae GGSF16 grow th

2.3醛對酒精生成的影響

糠醛對細胞生長的影響遠大于對酒精生成的影響［18］。由圖4與表3可知，隨著糠醛濃度的增加，乙醇的生成速率逐漸降低，但對最終酒精度以及發酵效率影響不大。先前的研究同樣表明，在糠醛存在的情況下，細胞的生長受到了明顯的抑制作用，然而乙醇的產量仍舊維持在較高的水平［7，19］。但由于糠醛的加入延長了發酵周期，從而使得乙醇產率隨著糠醛濃度的增大而逐漸降低（見表3）。當糠醛質量濃度為0時，乙醇產率最高為3.24 g/（L·h）。結果表明，隨著糠醛濃度的增大乙醇產率逐漸降低、發酵周期逐漸延長，但對最終酒精度的影響不大。因此，盡可能的降低木質纖維素水解液中的糠醛濃度有利于酒精發酵的過程。

圖4　不同糠醛質量濃度條件下酵母GGSF16酒精發酵過程中酒精生成曲線Fig.4 Alcohol production curve during the ferm entation process of S.cerevisiae GGSF16 from glucose at different furfural concentrations

表3　糠醛質量濃度對酵母GGSF16葡萄糖酒精發酵參數的影響Table 3 Effectof different furfural concentrations on alcohol ferm entation param eters of S.cerevisiae GGSF16 from glucose

3　結論

本試驗以調節不同濃度糠醛的YEPD發酵培養基替代木質纖維素水解液，通過對葡萄糖代謝曲線的擬合，分別得到了不同糠醛濃度條件下的發酵結束時間；并應用曲線下面積法整體評估了糠醛對發酵過程中幾個重要參數的影響，在不同糠醛濃度條件下酵母GGSF16葡萄糖酒精發酵結果表明，糠醛濃度的增加會導致葡萄糖代謝和細胞生長逐漸減慢、乙醇產率逐漸降低、發酵周期逐漸延長，但最終酒精度并沒有明顯差別。當糠醛質量濃度為0時乙醇產率最高，為3.24 g/（L·h）；發酵周期最短，為6.94 h。因此，在酒精發酵的過程中應盡可能的降低木質纖維素水解液中的糠醛含量。

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Effect of furfural on alcohol fermentation from glucose by Saccharomyces cerevisiae GGSF16

YU Zhiqiang，WU Shihua，ZHAO Dongling*，HUANG Cuiji，YIYi
（SchoolofBiologicaland Chemical Engineering，GuangxiUniversity ofScience and Technology，Liuzhou 545006，China）

The effect of different furfural concentration on alcohol fermentation from glucose by Saccharomyces cerevisiae GCSF16 wasexplored，which provided basic information for alcohol fermentation from lignocellulosic hydrolysate.YEPD medium was used instead of lignocelluloses hydrolysate，and the furfuralcontentwasadjusted to seven levels ranging from 0-2 g/L.Based on the areaunder curve，the effectof furfuralon thealcohol fermentation from glucosewasexplored.The results showed thatw ith the increase of furfural concentration，the fermentation period prolonged and the production of alcohol decreased，but no significant difference in alcohol content at the end.When the furfural concentration was 0，the ethanolyield was3.24 g/（L·h），and the fermentation period shortened to 6.94 h.

furfural；glucose；alcohol fermentation；Saccharomycescerevisiae；areaunder the curve

TS261．4

0254-5071（2016）01-0034-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．008

2015-11-03

廣西科技攻關項目（桂科攻0782003-2）；廣西高校科學技術研究項目（YB2014202）

于志強（1990-），男，碩士研究生，研究方向為纖維素酒精發酵。

趙東玲（1965-），男，工程師，博士，研究方向為微生物發酵。