耐有機溶劑脂肪酶菌株的篩選及其耐受特性初探

張梓涵，王　晨，竇迎春，劉　婭（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

耐有機溶劑脂肪酶菌株的篩選及其耐受特性初探

張梓涵，王晨，竇迎春，劉婭*
（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

以篩選獲得的新疆釀酒葡萄內生菌為出發菌株，首先采用含有橄欖油乳化劑及羅丹明B的平板初篩，再分別以體積分數1%正庚烷和1%甲苯為篩選壓力進行復篩，從中得到1株耐有機溶劑脂肪酶菌株M-CY1，經形態和分子生物學技術鑒定為Penicillium asturianum。該菌遺傳穩定性良好，菌種的酶活性與菌絲的生長量呈正相關，多種有機溶劑對該菌產脂肪酶活具有促進作用，其中二甲苯作用最為明顯，酶活為4.99U/m L，相對酶活達143.76%。

葡萄；內生菌；耐有機溶劑脂肪酶；篩選；鑒定

非水相酶學是發展至今不足20年的一個酶催化新興領域，這讓一些傳統方法難以合成的新型化合物及外消旋體拆分等得以實現，已超出了油-水界面上進行水解反應的范圍，能催化各種合成反應的進行，如酯合成、手性化合物拆分、高聚物合成、肽合成、油脂改性、含油廢棄物的生物修復處理等［1-4］。但選用有機溶劑作為反應介質的一個重要障礙是脂肪酶在有機相中容易發生結構重排而降解失活［1，5］，因此如何使用脂肪酶在有機相中仍能較好發揮作用，便成為發展非水相酶學的重要問題。當前，尋找能夠耐受有機溶劑的脂肪酶成為非水相酶學的研究熱點之一。由于微生物是當前工業用脂肪酶的重要來源，而脂肪酶在微生物界分布十分廣泛［6-9］，迄今為止國內外已有諸多學者對耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選及有機溶劑耐受性進行了研究，如Bacillus sphaericus205y［10］，Pseudomonas sp.S5［11］等。植物內生菌是潛力巨大的生物催化劑寶庫，植物內環境微生態的特殊性使其內生菌所產脂肪酶也有具有特殊性質的可能性，國內外已有學者從樹木葉部、根、棕櫚果實、橄欖樹等植物中篩選獲得了耐甲醇、乙醇、苯、丙酮、正己烷、二甲苯等有機溶劑的內生細菌和真菌［12-13］。目前，微生物產生的耐有機溶劑脂肪酶已用于有機相中多種化學反應的催化。但由于需要催化的化學方應類型多、產物浮躁，現有的耐有機溶劑脂肪酶源不能滿足工業上的多樣化需求，因此有必要尋找更多、更高效的耐有機溶劑微生物。鑒于新疆釀酒葡萄品種優良，地域特色明顯，生物多樣性豐富，本實驗利用已有的新疆釀酒葡萄內生菌，從中進行耐有機溶劑脂肪酶菌株篩選，并對其耐有機溶劑的特性進行初步的研究，從而為耐有機溶劑脂肪酶的分離純化及其應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1種來源

課題組實驗室保藏菌種，源自新疆釀酒葡萄，共73株，包括內生細菌、霉菌、酵母菌和放線菌。

1.1.2養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：用于內生真菌的活化［14］。牛肉膏蛋白胨培養基：用于內生細菌的活化［15］。高氏一號培養基：用于內生放線菌的活化［15］。

液體種子培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，定容至1 L，pH值為7.0，121℃滅菌20m in［15］。

無機鹽培養基：NaCl10 g，NH4Cl0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，KCl 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，加蒸餾水1 L，121℃滅菌20min［15］。

初篩平板培養基：無機鹽培養基高壓滅菌后，靜置至溫度為60℃左右時每l00m L加入含0.2%羅丹明B的聚乙烯醇橄欖油乳化液12m L［15］。

液體發酵培養基：無機鹽培養基高壓滅菌后，靜置至溫度為25℃左右時每100m L加入1m L過濾滅菌的甲苯或正庚烷［15］。

1.1.3學試劑

對硝基棕櫚酸苯酯（p-nitrophenylpalmitate，p-NPP）：美國Sigma公司；橄欖油：上海嘉里食品工業有限公司；羅丹明B（Rhodamine B，Rh B）：生工生物工程（上海）有限公司；聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）：上海國藥集團；乙腈、二氯甲烷、異丙醇：天津市福晨化學試劑廠；甲醇：天津市光復精細化工研究所；液體石蠟：天津市富宇精細化工有限公司；所有化學試劑均為國產分析純。

1.2器與設備

LXJ-IIB低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；722可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-JCV超凈臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；ZXSD-1160生化培養箱、ZHWY-111B恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；MOTIC B SERIES生物顯微鏡：麥克奧迪集團公司；FA1004電子天平：上海精科天平儀器廠；HHS-216恒溫水浴槽：常州國華電器有限公司。

1.3法

1.3.1有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選

將活化后的菌株分別接種到含有橄欖油乳化液及羅丹明B的初篩平板培養基上培養。產脂肪酶的菌株周圍在紫外燈照射下會有紅色的熒光圈。以菌落直徑與熒光圈直徑之比為篩選依據［16］，選擇比值大，即脂肪酶高產菌株作為復篩菌株，將其轉接至斜面培養基上備用。對于紫外燈下有紅色熒光圈的菌落，再分別以1%的正庚烷和1%的甲苯為篩選壓力，添加于液體發酵培養基中進行復篩，搖床轉速150 r/min，細菌培養24 h、霉菌培養72 h，發酵結束后，將發酵液5 000 r/min離心10min，取上清液測酶活力。

1.3.2肪酶活力檢測

酸堿滴定法［17］。在實驗溫度和pH條件下，每分鐘催化產生1μmol脂肪酸的脂肪酶的量定義為1個活力單位，以U表示。本實驗將1%正庚烷加入到無機鹽培養基中發酵培養后測得的脂肪酶活力為參照，以1%其他不同有機溶劑發酵培養后測得的酶活力為相對酶活。

取100m L錐形瓶向其中加入4m L 0.05mol/L的pH值為7.5的磷酸緩沖液和5m L橄欖油乳化液，置于45℃水浴中保溫5m in，然后加lm L粗酶液，在45℃水浴中振蕩10m in，取出立即加入15m L的無水乙醇，加入3滴酚酞指示劑，用0.05mol/L NaOH滴定溶液至呈粉紅色。空白對照是加入1m L滅活過的酶液（滅活方法為100℃水浴15min），其余操作都相同，測得菌株酶活力。每次測定重復3次，得平均值。酶活力計算公式如下：

式中：V為滴定樣液消耗的NaOH體積，mL；V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積，m L；t為反應時間，m in；n：酶液體積，m L；M為滴定用的NaOH溶液的濃度，mol/m L。

1.3.3標菌株的鑒定

采用載玻片培養法觀察菌株顯微形態，通過菌落形態和顯微特性的觀察初步鑒定耐有機脂肪酶菌株，再通過26SrDNA ITS區序列分析進行分子生物學鑒定，在GenBank中進行局部序列排比檢索基本工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）比較搜索，同時下載同源性序列，目標菌株序列提交GenBank，提取同源性高的序列并使用Phylip（Version3.68）軟件包構建系統發育樹，確定待測菌株與庫中已有記錄間的親緣關系。

1.3.4效菌株遺傳穩定性實驗

在PDA培養基中連續傳代培養5次，30℃培養72 h，檢測其產脂肪酶的遺傳穩定性。

1.3.5效菌株生長量、酶活與時間的關系

高效菌株在含有1%的正庚烷無機鹽培養基中，每隔12 h測其酶活和OD405nm值，分析菌體生長與產酶的關系。

1.3.6標菌株對有機溶劑的耐受規律研究

分別將正庚烷、乙腈、正丁醇、甲醇、乙醇、二氯甲烷、異丁醇、丙酮、石油醚、二甲苯、苯、正己烷、液體石蠟、異丙醇等14種有機溶劑以1%比例加入無機鹽培養基中，進行目標菌株的發酵培養，測其產脂肪酶活力及相對酶活，考察目標菌株對有機溶劑的耐受規律。

將目標菌株在含有不同濃度的二甲苯無機鹽培養基中發酵培養72 h，測定脂肪酶活，考察不同濃度的二甲苯對菌種脂肪酶活的影響規律。將目標菌株接在含有1%的正庚烷無機鹽培養基中，每隔12 h測其酶活和OD405nm值，分析菌體生長與產酶的關系。

2　結果與分析

2.1生菌耐受有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選

以73株葡萄內生菌為出發菌株，接種到以橄欖油乳化液為唯一碳源、羅丹明B為顯色劑的培養基上進行菌株產脂肪酶能力的初篩，紫外光觀察發現GUO-4、M-CY1、C1Y1、XP201、Q-G-3-2、J-CY1、Q-G-2-1這7株菌呈現橙紅色熒光圈。

測量這7株菌的熒光圈直徑和菌落直徑，并計算熒光圈直徑與菌落直徑比值，結果見表1。由表1可知，M-CY1的直徑比值最大，說明其產脂肪酶的能力較強。

表1　熒光圈直徑與菌落直徑比Table 1 Ratio of fluorescent ring diameter and colony diameter

對初篩得到的7株菌分別以1%甲苯和1%正庚烷為篩選壓力在28℃、150 r/min條件下進行液體發酵培養，脂肪酶活檢測和OD405nm值，結果如圖1所示。

圖1　不同菌株在含有甲苯（A）及正庚烷（B）的培養基中的生長量及脂肪酶活狀況Fig．1 Grow th and lipase activity o f differentstrains inm edium w ith methylbenzene（A）and n-heptane（B）

由圖1可知，菌株M-CY 1在甲苯和正庚烷中都具有較高的酶活性，因此選擇M-CY1為耐有機溶劑脂肪酶產生菌目標菌株。

2.2標菌株的鑒定

對菌株M-CY1在PDA培養基上的菌落形態進行觀察，結果見圖2。由圖2可知，發現菌落呈近圓形，直徑約30mm，平坦分布，呈絨狀質地，中間青灰色周圍白色，背面橙紅色，周圍泛黃。顯微形態觀察發現其為無色的無隔菌絲，孢囊梗直立，沒有假根，多次分枝，具體菌落及顯微形態見圖2。

圖2　菌株M-CY1的菌落形態和顯微形態Fig．2 Colonialand microscopicmorphology of strain M-CY1

為進一步確定耐有機溶劑脂肪酶產生菌M-CY1的分類學地位，對其進行了DNA測序，結果見圖3。由圖3可知，在750～500 bp之間出現明顯的亮帶，說明PCR擴增成功，滿足DNA序列測定要求。得其26S rDNA ITS區的基因全長為564 bp。對其基因序列進行分析后構建系統發育樹如圖4所示。

圖3菌株M-CY1的PCR產物電泳圖譜Fig．3 Electrophoretogram of PCR products of strain M-CY1

由圖4可知，與美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上已有的序列進行BlAST同源性檢索，發現其26SrDNA ITS和Penicillium的多株菌同源性達99%，而與Penicillium asturianum最接近，即確定菌株M-CY 1為Penicillium asturianum。

圖4 菌株M-CY1的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain M-CY1

2.3落產脂肪酶的遺傳穩定性

將菌株M-CY1進行連續傳代培養，測定其在甲苯和正庚烷中的脂肪酶活力，結果見表2。

表2　菌株M-CY1產耐有機溶劑脂肪酶遺傳穩定性試驗結果Table 2 Results of the genetic stability testof strain M-CY1 w ith organic solvents-tolerant lipases production　U/m L

由表2可知，菌株M-CY1產脂肪酶活性經5代連續培養，酶活變化不明顯，說明菌株M-CY 1產生的脂肪酶具有良好的遺傳穩定性。

2.4效菌株M-CY1產脂肪酶活力與菌株生物量

圖5　菌體生物量和脂肪酶活的相關性Fig.5 Correlation of biomass and lipase activity

為了解菌株M-CY1生長和產酶的關系，從而在適宜時間得到脂肪酶活力較高的發酵液，對高效菌株M-CY1每隔12 h測量一次酶活力和OD405nm值，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著培養時間的增加菌株M-CY1的產脂肪酶活力逐漸升高，72 h酶活力達到最高。當超過72 h后，內生菌產脂肪酶活力呈下降趨勢。OD405nm值即菌株生物量在一定的時間范圍內呈正態，60 h之前和時間呈正比，60 h之后呈反比狀態。綜上可得，菌株的生物量與菌種的酶活性大致呈正相關。

2.5標菌株對有機溶劑的耐受規律

2.5.1效菌株對多種有機溶劑的耐受性檢測

選取了14種不同種類的有機溶劑，包括烷烴、環烷烴、醇類、酮類等，以1%的比例添加于無機鹽培養基中，由于重點研究正庚烷對目標菌株M-CY1的影響，因此以1%正庚烷中的脂肪酶活為對照，觀察目標菌株M-CY1的菌體生長情況，測定脂肪酶活力，結果見表3。

表3　菌株M-CY1在有機溶劑中的生長量和脂肪酶活Table 3 Grow th and lipase activity o fstrain M-CY1 in organic solvent

由表3可知，菌株在M-CY1所給的有機溶劑中都能生長，但生長程度和酶活有所不同，苯和甲醇對該菌所產脂肪酶有一定抑制作用，而石油醚、二甲苯、液體石蠟和異丙醇能促進菌體產脂肪酶。其中二甲苯中菌株M-CY1的脂肪酶最高，為4.99U/m L，相對酶活為143.76%。

2.5.2甲苯對高效菌株M-CY1產脂肪酶活力的影響

為了解二甲苯濃度對菌株產脂肪酶活力的影響，在液體發酵培養基中添加不同含量的二甲苯，測定其脂肪酶活，結果見表4。

表4　不同濃度二甲苯對脂肪酶活的影響Table 4 Effect of differen t xylene concentration on lipase ac tivity

由表4可知，隨著二甲苯含量的升高，脂肪酶活逐漸下降。這可能是由于有機溶劑直接與酶作用，破壞維持酶蛋白活性構型的氫鍵和疏水相互作用，抑制了酶的活性。但在含量高達50%的二甲苯中，菌體仍然能夠生長，且保持一定脂肪酶活力，說明菌株對二甲苯具有較高耐受特性。

3　結論

本實驗利用橄欖油乳化劑為唯一碳源的羅丹明B平板法初篩從73株葡萄內生菌中獲得了7株能夠產脂肪酶的菌株，并以1%的甲苯和正庚烷為篩選壓力復篩得到1株耐有機溶劑脂肪酶高效目標菌——M-CY1。形態和分子學研究表明，M-CY 1為Penicillium asturianum，其產脂肪酶的遺傳性狀穩定，且能夠耐受多種有機溶劑，在二甲苯中生長和產酶情況最好，酶活達4.99U/m L，且該菌所產脂肪酶能耐受濃度高達50%的二甲苯溶液，體現了較強的有機溶劑耐受特性。該菌所產脂肪酶對有機溶劑的廣譜耐受性，既為此脂肪酶在非水相介質的靶向應用奠定基礎，也為生物降解由這些有機溶劑導致的環境污染提供了參考。

［1］GUPTA A，KHARESK.Enzymes from solvent-tolerantmicrobes:useful biocatalysts for non-aqueous enzymology［J］.Crit Rev Biotechnol，2009，29（1）:44-54.

［2］PATIL K J，CHOPDA M Z，MAHAJAN R T.Lipase biodiversity［J］.Indian JSci Tec hn，2011，4（8）:971-982.

［3］袁靜.耐有機溶劑脂肪酶產生菌篩選及粗酶性質研究［D］.南京：南京工業大學碩士論文，2008.

［4］GLOGAUER A，MARTINIV P，FAORO H，et al.Identification and characterization of a new true lipase isolated throughmetagenomic approach［J］.M icrob Cell Fact，2011（10）:54-68.

［5］DOUKYU N，OGINO H.Organic solvent-tolerantenzymes［J］.Biochem Eng J，2010，48（3）:270-282.

［6］KUMAR S S，GUPTA R.An extracellular lipase from Trichosporon asahii MSR 54:Medium optim ization and enantioselective deaectylation ofphenylethylacetate［J］.Process Biochem，2008，43（10）:1054-1060.

［7］CIAFARDINIG，ZULLOB，IRIDEA.Lipase production by yeasts from extra virgin olive oil［J］. Food M icrobiol，2006，23（1）:60-67.

［8］ANNIBALE A D，SERMANNIG G，FEDERICI F，et al.Olive-m ill wastewaters:a promising substrate formicrobial lipase production［J］. Bioresource Technol，2006，97（15）:1828-1833.

［9］HE Y，TAN T.Use of response surfacemethodology to optim ize culture medium for production of lipasew ith Candida sp.99-125［J］.J M olecul Catal B：Enzym，2006，43（1-4）:9-14.

［10］HUN C J，RAHMAN R N Z A，SALLEH A B，etal.A new ly isolated organic solvent-tolerant Bacillus sphaericus 205y producing organic solvent-stable lipase［J］.Biochem Eng J，2003，15（2）:147-151.

［11］BAHARUM SN，SALLEH A B，RAZAK C N A，et al.Organic solvent-tolerant lipase by Pseudomonas sp.strain S5:stability of enzyme in organic solventand physical factors affecting its production［J］. Ann M icrobiol，2003（53）:75-83.

［12］葉濤.橄欖樹內生菌分離及其耐有機溶劑脂肪酶的研究［D］.福州：福建師范大學碩士論文，2011.

［13］胡朝陽，韋晗寧，李春苑.產脂肪酶菌株的篩選及酶學特性研究［J］.廣西農業生物科學，2006，25（3）：261-268.

［14］劉慧，張紅星.現代食品微生物學實驗技術［M］.北京：中國輕工業出版社，2006.

［15］何茹.葡萄內生菌中耐有機溶劑脂肪酶菌株的篩選及酶學特性研究［D］.石河子：石河子大學碩士論文，2014.

［16］李俊峰，李紅芳，段效輝，等.耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選及其粗酶酶學性質［J］.食品科學，2012，33（3）：116-120.

［17］江慧芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進［J］.化學與生物工程，2007，24（8）：72-75.

Screening of organic solvent tolerance lipase-producing strains and tolerance property of the lipase

ZHANG Zihan，WANG Chen，DOU Yingchun，LIU Ya*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China）

Using the endophyte in Xinjiangw inegrapeasoriginalstrain，the strainswere screened preliminarily by oliveoilemulsifier and rhodamine B plate，and screened secondarily by selection pressure of 1%n-heptane and 1%methylbenzene.The lipase production of strain M-CY 1 w ith organic solvent tolerancewasobtained and identified as Penicillium asturianum by themorphology andmolecular biology techniques.The strain had good genetic stability.Theenzymatic activity of the strainwaspositively relatedw ith grow th ofmycelia.A variety of organic solvents for the activity of lipaseproduced from strainshad apromoting effect，and the promoting effectof xylenewas themostobvious.Theenzymeactivitywas4.99U/m l，and the relative enzyme activity reached to 143.76%.

grape；endophyte；organic solvent tolerance lipases；screen；identification

Q93

0254-5071（2016）01-0019-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．005

2015-11-08

國家自然科學基金（31460031）；兵團博士資金（2014BB006）

張梓涵（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。

劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。