激光損傷后不同時間點鼠視網膜中水通道蛋白-1的表達

潘海濤，潘士勇，丁　淳，趙迎峰

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·論著·

激光損傷后不同時間點鼠視網膜中水通道蛋白-1的表達

潘海濤，潘士勇，丁淳，趙迎峰

目的采用免疫組化、熒光定量PCR法觀察激光損傷后不同時間鼠視網膜中水通道蛋白-1(aquaporin-1,AQP-1)的分布及其mRNA表達的變化。方法Brown Norway(BN)大鼠激光損傷視網膜后，脊椎脫臼法處死，摘除眼球，4%福爾馬林固定，石蠟包埋。平行視神經矢狀連續切片，HE染色、免疫組化染色和陰性對照。用已知有AQP-1表達的正常大鼠眼球眶周組織中的血管切片為陽性對照。另取出大鼠眼視網膜組織，行實時定量PCR檢測。結果免疫組化切片顯示，褐色粗顆粒出現在大鼠眼組織細胞中為陽性，無則為陰性。實時熒光定量PCR結果顯示，正常組AQP-1 mRNA表達量為：(1.15±0.01)，激光損傷即刻：(1.10±0.01)；12 h：(1.10±0.03)；24 h：(1.16±0.01)；72 h：(1.13±0.01)。結論AQP-1在眼內陽性表達于多個與水代謝有關的部位，視網膜上AQP-1 mRNA的表達在激光損傷后呈現動態變化，激光損傷初期呈上調，損傷后期呈下調表達。

水通道蛋白-1；免疫組化；熒光定量PCR；BN大鼠

近些年，我國人口老齡化進程不斷加速，老年性黃斑變性等一系列視網膜性疾病逐漸成為老年人中主要致盲性眼病。在糖尿病性視網膜病變等新生血管性疾病的發病過程中，視網膜色素上皮細胞的損傷常常被認為是它們的始動因素，它可導致局部視網膜處于低氧狀態，繼而引起視網膜屏障破壞，視網膜水腫等一系列問題[1-2]。本實驗通過應用免疫組化法及實時熒光定量PCR法觀察激光照射后不同時間鼠視網膜中水通道蛋白-1(aquaporin-1，AQP-1)的分布及mRNA的變化，并分析其變化特征，以期為下一步探索激光損傷視網膜，探討AQP-1在激光所致視網膜水腫形成發展中的作用及其相關機制打下基礎。現將研究結果報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物南京總醫院動物實驗中心提供的12周齡雄性、健康Brown Norway(BN)大鼠30只，體重170～220 g。實驗動物合格證號SCXK(軍)2012-0014，實驗動物許可證號SYXK(軍)2012-0046。

圖1　激光損傷鼠視網膜模型

1.2動物模型建立、分組及取材BN大鼠隨機分成5個組：正常對照組、激光損傷后即刻、12 h、24 h、72 h，每組6只。單眼充分散瞳，蓋玻片接觸角膜，激光光凝散瞳眼視網膜，離視盤約2個視盤直徑外4個象限均勻光凝50個點。多次預實驗后，設置氬激光參數：532 nm波長，曝光時間0.1 s，光斑為50 μm，能量100 mw，正常眼為對照分析。大鼠視網膜激光損傷后，摘除眼球，慶大霉素(50 U/mL)+0.9%生理鹽水徹底沖洗。去除眼前段組織，鑷子輕輕夾取視網膜組織放置凍存管中，立即保存于-80 ℃溫度下，整個操作過程力求保持無菌。正常對照的BN大鼠不需激光處理以同樣的方式取出視網膜。

1.3主要儀器設備及試劑光學顯微鏡及攝像系統OLYMPUS CKX41(日本)，視網膜系統分離儀Viridis Twin(法國),ZT-12H生物組織自動脫水機(湖北亞光),YB-6生物組織包埋機(湖北亞光),超薄切片機LEICA RM2235(德國),DAB顯色試劑盒(Dako公司)，羊抗兔IgG-HRP(杭州華安),兔抗鼠AQP-1多克隆抗體(abcam公司),4%多聚甲醛溶液(南京化學公司)。

1.4免疫組織化學檢查脊椎脫臼法處死大鼠，摘除眼球，4%多聚甲醛固定；石蠟包埋，平行視神經矢狀位連續切厚4 μm的切片，每個標本切2片用于HE染色和AQP-1染色；脫蠟，水化后置入3%甲醇、0.5%H2O2中37 ℃溫度下孵育30 min以清除內源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗后分別滴加正常兔血清30 μL，兔抗鼠AQP-1多克隆抗體工作液(一抗)及稀釋液配制的辣根過氧化酶化羊抗兔IgG二抗工作液，37 ℃溫度下孵育30 min。磷酸鹽緩沖液充分洗滌；吸干PBS液，滴加DAB染色，蒸餾水沖洗；蘇木素復染3 min，氨水返藍；酒精梯度順序脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，加蓋玻片，拍照。1.5實時熒光定量PCR檢查樣品總RNA用TRIzol法提取，將RNA反轉錄成cDNA；根據基因序列設計特異性引物(G￣A￣P￣D￣H￣-￣F￣：￣T￣G￣T￣G￣T￣C￣C￣G￣T￣C￣G￣T￣G￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣A￣；￣G￣A￣P￣D￣H￣-￣R￣：￣T￣T￣G￣C￣T￣G￣T￣T￣G￣A￣A￣G￣T￣C￣G￣C￣A￣G￣G￣A￣G￣)￣，以GAPDH為內參基因，做相對定量檢測。

2　結　果

2.1激光損傷鼠視網膜模型如圖1所示：圍繞視乳頭，距離視乳頭邊緣約2個視盤直徑外可見激光損傷照射點，均勻分布于四個象限之中，避開網膜血管，激光斑區域網膜色澤灰白，透亮，激光斑周圍網膜局部水腫。

2.2免疫組化染色光鏡下AQP-1免疫組化切片顯示，褐色粗顆粒出現在大鼠眼組織細胞中為陽性，無則為陰性。棕色顆粒顏色越深，表示陽性強度越大。以已知大鼠眼球眶周脂肪組織中的血管管壁AQP-1染色的為陽性對照(圖2)，正常大鼠眼視網膜組織中AQP-1陽性表達部位主要位于：視網膜神經節細胞層，內核層(圖3)。圖4～7為激光損傷后不同時間點的視網膜組織結構圖。

圖2　AQP-1染色的為陽性對照(×200)

圖3　正常大鼠眼視網膜組織中AQP-1陽性表達部位(×200)

圖4　光損傷即刻視網膜組織結構圖(×200)

圖5　光損傷12 h視網膜組織結構圖(×200)

圖6　光損傷24 h視網膜組織結構圖(×200)

圖7　光損傷72 h視網膜組織結構圖(×200)

2.3熒光定量PCR檢測實時定量PCR結果顯示(表1)，正常組AQP-1 mRNA表達量為：(1.15±0.01)，激光損傷組分別為：即刻：(1.10±0.01)，激光損傷后12 h：(1.10±0.03)，激光損傷后24 h：(1.16±0.01)，激光損傷后72 h：(1.13±0.01)。與正常組相比，激光損傷即刻組與激光損傷12 h組差異均有統計學意義(均P<0.01)；激光損傷24 h組和激光損傷72 h組的差異均沒有統計學意義(均P>0.05)。圖8激光照射誘導后不同時間點鼠視網膜中AQP-1 mRNA的相對表達柱狀圖示：激光損傷后鼠視網膜中AQP-1 mRNA的表達呈動態變化，在損傷前12 h其表達不斷上調，至12 h達頂峰，后隨著時間的延長不斷下調表達。每個標本做3次復孔反應，ct值相接近，說明該實驗的重復性好(ct：熒光信號到達預先設定的閡值時所發生的重復次數)。

表1　激光照射誘導后不同時間點

3　討　論

水通道蛋白(AQPS)是近些年來發現的一組能夠快速跨膜轉運水運動的非選擇性細胞膜轉運蛋白，它普遍存在于動、植物和微生物中[3]。它主要參與體內液體的分泌和吸收，在調節和維持機體器官和組織的生理功能中發揮重要作用。AQP-1和AQP4是目前視網膜上僅發現的兩種亞型蛋白，其中AQP-1的含量約為AQP4的7倍[4-5]。AQP-1在視網膜的無長突細胞[6]、色素上皮細胞[7]和光感受器細胞[8]等多種細胞均有表達，主要分布于外側視網膜。這種特征性的分布模式提示，AQP-1在調節視網膜內水、電解質轉運均衡以及維持正常視覺功能中發揮非常重要的作用。

視網膜色素上皮細胞與視網膜激光損傷發生和修復的全過程聯系，視網膜激光照射后形成激光斑，激光斑范圍視網膜光感受器細胞凋亡、壞死，形成瘢痕組織，視網膜色素上皮、神經上皮與布魯赫膜產生粘連，視網膜色素上皮液體轉運功能增強。同時，激光斑周圍網膜發生局限性水腫，而這一般為神經節細胞和水平細胞的水腫。大量的研究表明，視網膜水腫形成是青光眼等高眼壓病人的主要病理改變，它是導致視網膜神經細胞損傷，視覺功能下降的重要原因[9]。之前大量文獻報道了AQP-4與視網膜水腫的相關性，而AQP-1報道的相對較少。

實時定量PCR技術是一種定量分析處理方式，它是在半定量、定性PCR技術原理上被提出來的,成為當下研究mRNA表達水平最熱門的技術之一[10-11]。本實驗運用免疫組化法、實時熒光定量PCR法觀察激光照射誘導后不同時間鼠視網膜中AQP-1的分布及其mRNA表達的變化。免疫組化染色證實AQP-1在眼內與水代謝有關的多個部位呈陽性表達，實時熒光定量PCR結果顯示，與正常組AQP-1 mRNA表達量相比，激光損傷后4個時間點中，只有激光損傷后即刻組與激光損傷12 h組差異有統計學意義(P<0.01)。我們觀察到AQP-1的表達在視網膜激光損傷后呈現動態變化：在激光損傷初期其呈上調表達，在激光損傷后其呈下調表達。先前有研究提示視網膜挫傷后視網膜會發生水腫，并且視網膜水腫是動態變化的[12]。因此我們大膽推測激光損傷視網膜上AQP-1表達的動態變化與視網膜水腫的動態變化這兩者之間可能存在一定的關聯性，如圖4～7所示，與正常網膜結構比較后發現，激光損傷后不同時間的網膜組織中，視神經細胞層與內核層均有不同程度的水腫。AQP-1可能促進視網膜水腫的形成和發展，也有可能起到保護作用，具體作用暫不能定論，還有待進一步的研究探索。眼組織中AQP-1的調節機制目前尚不十分清楚，在分子與基因水平還存在著組織特異性調節，調節的因素包括細胞因子、神經遞質和激素等[13-15]。離子濃度、細胞成分、容積滲透壓等平衡均跟水含量密切相關，它們的異常表達會影響基因的表達、蛋白質分子的功能與結構，從而影響細胞的結構與功能。眼組織中AQP-1適量表達和功能活性正常，是保證這一切正常的先決條件。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Expression of aquaporin-1 in rat retina at different time points after laser injury

PAN hai-tao,PAN Shi-yong,DING Chun,ZHAO Ying-feng.

DepartmentofCadreHealth,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China

ObjectiveUsing immunohistochemistry method, fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) to observe the AQP-1 distribution at rat retina and mRNA expression changes in different time after laser injury. MethodsThe Brown Norway (BN) rats were killed by spinal dislocation method after laser damaged, removed the eyeball, fixed in 4% formalin and embedded in paraffin. Parallel optic sagittal serial sections, HE staining, immunohistochemical staining and negative control were performed. Use the vascular slice in normal rat eyes’periorbital tissue, in which AQP-1 expression was known as a positive control. Remove the eye retina tissue of rats and check it with line real-time quantitative PCR. ResultsAQP-1 immunohistochemical examination showed brown coarse particles in rat ocular tissues and cells as positive, no as negative. Real-time PCR results showed normal AQP-1 mRNA expression level: 1.15±0.01; laser damage instantly: 1.10±0.01; 12 hours: 1.10±0.03; 24 hours:1.16±0.01; 72 hours:1.13±0.01. ConclusionAQP-1 is expressed in many parts of the water metabolism, and the expression of AQP-1 mRNA in the retina after laser injury shows dynamic changes, which of the initial laser damage was up, and the latter was down.

aquaporin-1; immunohistochemistry; fluorescence quantitative PCR; BN rats

南京軍區醫學科技創新項目(12MA086)

210002江蘇南京，南京總醫院干部保健科

趙迎峰，E-mail：419569735@qq.com

R774.1

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.005

2016-03-11；

2016-05-25)

引用格式：潘海濤，潘士勇，丁淳，等.激光損傷后不同時間點鼠視網膜中水通道蛋白-1的表達[J].東南國防醫藥，2016,18(4):354-357.