DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR對AID基因修飾的牛胎兒成纖維細胞的作用

奧旭東 薩如拉 王杰 王會敏 于海泉

（內蒙古大學實驗動物研究中心，呼和浩特 010021）

DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR對AID基因修飾的牛胎兒成纖維細胞的作用

奧旭東 薩如拉 王杰 王會敏 于海泉

（內蒙古大學實驗動物研究中心，呼和浩特 010021）

以轉AID基因細胞和AID基因敲減細胞為研究對象，旨在探討5-氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）對其細胞形態、細胞周期、相關基因表達及其基因啟動子區甲基化狀態變化的影響。此外，還分析了整體基因組去甲基化和位點特異性去甲基化之間存在的差別，探討提高體細胞重編程效率的方法及其作用機制。通過Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）、Western blotting和流式細胞術等技術分析了5-Aza-CdR對轉AID基因細胞和AID基因敲減細胞的影響。結果表明，5-Aza-CdR對轉AID基因細胞的影響存在明顯的劑量效應，濃度為4 μmol/L時，具有明顯的細胞毒性，大量細胞死亡（P＜0.05）。當使用處理濃度為1-3 μmol/L時，細胞形態發生改變，細胞增殖被抑制。核型分析顯示，3 μmol/L濃度組處理就可以導致轉AID基因細胞出現異常核型。使用1 μmol/L濃度處理細胞，明顯增加了表達報告基因細胞的數量，細胞AID和SOX2的表達量都有所提高，并且SOX2基因啟動子區的DNA甲基化水平也有所下降。5-Aza-CdR處理AID基因敲減細胞后，OCT4和SOX2的表達量較對照組明顯升高，而NANOG卻沒有發生變化。結果顯示，5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞可改變細胞形態、細胞周期和報告基因的表達，5-Aza-CdR處理后基因組整體去甲基化和AID基因的位點特異性去甲基化協同作用于體細胞重編程。

5-Aza-CdR；AID基因；DNA去甲基化；體細胞核移植

胚胎發育過程是細胞全能性逐漸喪失的過程［1］，有研究顯示，2-細胞期到4-細胞期的小鼠胚胎各個卵裂球已表現出不同的發育傾向［2］，隨著胚胎的發育，各個細胞不斷地向既定的方向發生分化。在發育過程中，基因組經歷多種表觀遺傳修飾，導致基因的表達狀況也隨之發生了改變，由此產生了不同的分化表型。已分化的細胞可以經過去分化被逆轉到未分化狀態，從而獲得發育的全能性，這一過程被稱為體細胞重編程［3］。誘導體細胞重編程的方式主要包括體細胞核移植（SCNT）、體細胞與多潛能細胞融合、胚胎干細胞提取物處理以及轉錄因子介導的誘導多能干細胞（iPS）。

核移植和iPS技術被認為是到目前為止誘導體細胞重編程最為完全、最具有再生醫學臨床應用潛能的技術。目前人們已經獲得了多種核移植動物和iPS細胞［4-9］，然而這兩項技術也存在很大的局限性，如iPS細胞的效率低下，體細胞克隆胚胎發育率低，流產率高及異常個體等，這些都是制約這兩項技術廣泛應用的主要因素［10，11］。其中，造成體細胞克隆胚胎發育異常以及iPS細胞重編程的效率極低的主要原因是體細胞基因組不能完全的去分化、不能正常啟動重編程過程。

基因組DNA甲基化是表觀遺傳調控的重要方式［12］。有研究表明，克隆胚胎基因組的異常甲基化是引起克隆胚發育率和出生率低的主要原因之一［13］。高甲基化的癌細胞DNA去甲基化后發生肌源性重組，可以提高其iPS的重編程效率［14］。目前研究表明，去甲基化藥物可以使抑癌基因去甲基化，從而恢復其功能治療腫瘤［15］。5-氮胞苷（5-azacytidine，5-AzaC）是一種原型的DNMT抑制劑，而5-氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxy-cytidine，5-Aza-dC）是5-AzaC的脫氧核糖類似物。它們具有較強的DNMT抑制作用，其通過抑制了DNMT的作用來降低基因組的DNA甲基化水平，從而調節基因表達和介導細胞分化［16-18］。

活化誘導的胞嘧啶核苷脫氨酶蛋白（Activationinduced cytidine deaminase，AID）主要因其在B淋巴細胞中產生抗體多樣性的作用被人們廣泛認識［19-21］。隨后，研究人員發現AID蛋白可以將5mC脫氨基成為T，從而導致在T-G不匹配［18］。而AID基因表達于具有多能性的組織中［22］，這都暗示其具有DNA去甲基化作用。研究證實在小鼠［23，24］和斑馬魚［25］中AID基因具有DNA主動去甲基化作用。小鼠中的研究雖然表明AID基因具有DNA主動去甲基化作用，但是其作用并不是針對全基因組的而是具有一定的位點特異性［23］。目前，還未見用DNA去甲基化藥物5-Aza-CdR與AID基因聯合作用對重編程影響的報道。因此，5-Aza-CdR在體細胞重編程中與AID基因作用的關聯還不是很清楚，還需進一步探討。本研究以轉AID基因細胞和AID基因敲減細胞為研究對象，探討5-Aza-CdR對其細胞形態、細胞周期、相關基因表達及其基因啟動子區甲基化狀態變化的影響；并分析整體基因組去甲基化和位點特異性去甲基化之間存在的差別，以期為體細胞克隆效率的提高奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

5-Aza-CdR購自Sigma公司，MTT購自Promega公司，An-nexin-V購自Invitrogen公司。除特別提到的化學試劑，其余均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1轉AID基因細胞及AID敲減細胞的獲得 轉AID基因細胞的獲得使用脂質體LipofectamineTM2000（Invitrogen）轉染本實驗室構建的過表達載體pCDsRed-PbAID。轉染48 h后消化細胞，重新接種于10 cm培養皿中，加入G418，每3 d換液1次。待培養皿中形成表達紅色熒光蛋白的抗藥克隆時，用克隆杯消化后接種于24孔板后，擴大培養。

用于敲減AID基因的siRNA沒有篩選標記，不能長期干擾AID基因的表達。為了保證AID-siRNA能夠高效的轉染牛胎兒成纖維細胞并起到干擾作用，本研究使用本實驗室轉染效率比較高的電轉染方法來轉染AID-siRNA。該方法轉染pDsRed-C質粒轉染效率能夠達到80％左右。AID基因敲減細胞的獲得參照以下步驟：第3代牛胎兒成纖維細胞培養2-3 d后，細胞單層匯合度達到70％-80％，胰酶消化細胞，1 200 r/min室溫離心5 min。棄上清，根據細胞數量，加入適量的電轉緩沖液重懸細胞并吹打均勻。加入終濃度為100 nmol/L siRNA，按照預定條件設置參數250 V，5 ms，2次，進行電擊。將電轉杯置于37℃培養箱中孵育8-12 min，然后將細胞懸液接種于培養皿中，正常培養4 h，待細胞貼壁后，換新鮮的完全培養液，以去除上層的死細胞。培養24 h后，進行相關的實驗處理。

1.2.25-Aza-CdR處理體細胞及細胞毒性、凋亡與周期的分析 5-Aza-CdR用培養液DMEM/F12溶解，配制成1 mol/L的濃儲液，-20℃儲存。當細胞生長達到對數生長期，在培養孔里分別加入終濃度為1、2、3和4和5 μmol/L的5-Aza-CdR處理24 h或48 h。

收集對數生長期細胞，調整細胞濃度為2 000 cells /孔置于96孔板。37℃，5％ CO2培養2 d后，加入梯度濃度的5-Aza-CdR。然后37℃，5％ CO2孵育24 h或48 h，PBS洗2遍，加入100 μL細胞培養液。每孔加入20 μL 0.5％ MTT溶液，繼續培養4 h。每孔加入100 μL DMSO混勻后酶聯免疫檢測儀檢測OD490 nm。生存細胞的百分比計算方法如下：細胞生存能力抑制率（％）=［1-（OD treatment-OD blank）/（OD control-OD blank）］×100％。

調整待檢測的細胞濃度為2×106-5×106/mL。加入5 μL的Annexin V，室溫孵育3 min，20 μg/mL 的PI染核。避光室溫孵育10 min后，經流式細胞儀（Beckman Coulter，SC）檢測。

5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞，20 μg/mL的PI染核后使用Beckman流式細胞儀檢測細胞周期，使用Cell Cycle軟件（Beckman Coulter）分析數據。處理后體細胞核型的檢測方法使用本實驗室常規制作檢測方法。

1.2.35-Aza-CdR處理體細胞基因的表達及其甲基化變化分析 挑選生長狀態良好的轉AID基因細胞克隆提取RNA后，經反轉錄后進行Real-time PCR反應。PCR特異性引物以牛AID、OCT4、NANOG 和SOX2基因為模板進行設計。引物序列見表1。在ABI 7300實時熒光定量PCR儀反應后，使用2-ΔΔCT方法與GAPDH相比較后得到AID基因及多能基因的表達。

表1　牛Real-time PCR引物序列和反應產物

挑選生長狀態良好的轉AID基因細胞克隆提取DNA。基因組DNA經過Xho I（TaKaRa）酶切后，用亞硫酸氫鹽處理，然后用乙醇沉淀的方法回收DNA用于PCR。引物序列見表2。

1.2.4統計分析 所有試驗數據使用SPSS 14.0軟件進行統計分析。Real-time PCR試驗結果使用單因素分析，而DNA甲基化狀態使用卡方檢驗。P＜0.05確定為差異的顯著性。

表2　牛BSP-PCR引物序列和反應產物

2　結果

圖1　5-Aza-CdR對細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響

2.15-Aza-CdR對轉AID基因細胞生長的影響

本實驗使用梯度濃度的5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞，并分析了5-Aza-CdR處理后的細胞周期，細胞形態和其細胞毒性作用。結果（圖1-A）顯示，不同濃度的5-Aza-CdR處理24 h后，1、2 和3 μmol/L與對照組相比細胞活性沒有明顯差異（P＞0.05），而且相鄰濃度之間也不存在顯著性差異。但隨著5-Aza-CdR濃度的繼續升高，細胞活性明顯降低（P＜0.01）。1 μmol/L 5-Aza-CdR處理48 h后，所有處理組都與對照組差異極顯著，而不同濃度之間只有2 μmol/L 和3 μmol/L 之間沒有差異（P＞0.05）。由此可見，隨著5-Aza-CdR作用濃度的增加，死細胞數明顯增多，細胞耐受性減弱，活性明顯下降；相同濃度作用下，隨著處理時間的延長，細胞活性呈顯著下降趨勢（圖1-B）。細胞凋亡實驗（圖1-D）表明，隨著5-Aza-CdR處理濃度的增大，早期凋亡率并沒有明顯的升高趨勢，晚期凋亡率在個別濃度處理下有所下降，但是死亡細胞的比例卻顯著增加（P＜0.01），細胞發生凋亡的比例也與5-Aza-CdR處理濃度呈正相關。通過流式細胞儀，對5-Aza-CdR處理24 h組進行了細胞周期分析，結果（圖1-C）顯示經過1、2和3 μmol/L 5-Aza-CdR處理24 h后，G0/G1期和G2/M期細胞增多，S期細胞減少。而且發現在2 μmol/L和3 μmol/L處理組中出現了少量比例的非整倍體細胞，這說明高濃度的5-Aza-CdR會增加非整倍體的幾率，對細胞有毒性作用。

此外，5-Aza-CdR處理24 h后，處理組細胞形態與對照組沒有明顯的變化（圖2-A），但是48 h處理組與24 h相比，細胞形態更加扁平，細胞間隙變大（圖2-B）。使用1、2和3 μmol/L濃度的5-Aza-CdR分別處理轉AID基因細胞24 h后，檢測細胞染色體倍性的變化（圖3）。結果（表3）表明，1、2和3 μmol/L處理組都造成了體細胞整倍性率的降低，分別為78％、71％和60％，其中3 μmol/L處理組與對照組具有顯著性差異。由此可見高濃度（3 μmol/L）的5-Aza-CdR處理會導致染色體數目的異常。

圖2　不同濃度5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞24 h（A）及48 h（B）對其細胞形態的影響

表3　5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞染色體倍性分析

2.25-Aza-CdR對轉AID基因細胞AID等基因表達的影響

使用1 μmol/L 5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞后，表達紅色熒光蛋白（DsRed）的細胞數量及其熒光的表達強度都明顯增加（圖4-A）。說明5-Aza-CdR能夠誘導失活的DsRed啟動子CMV重新激活。

使用Real-time PCR的方法檢測到穩定轉染AID基因的牛胎兒成纖維細胞AID基因和多能性基因OCT4和NANOG表達明顯上升，但是SOX2基因的表達卻沒有明顯的改變；經5-Aza-CdR處理后，SOX2的表達量都明顯提高（圖4-B）。為了進一步分析5-Aza-CdR處理后SOX2的表達變化的原因，使用亞硫酸氫鹽PCR測序的方法分析了1 μmol/L 5-Aza-CdR處理的AID轉基因細胞中OCT4、NANOG 和SOX2啟動子區DNA甲基化水平。結果（圖4-C）顯示，5-Aza-CdR的處理降低了這些基因的甲基化水平，其中SOX2的變化具有顯著性差異。

2.35-Aza-CdR對AID基因敲減細胞的影響

圖3　5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞對其染色體倍性的影響

圖4　5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞對其基因表達的影響

為了進一步確認干擾片段能夠有效地在牛胎兒成纖維細胞中起作用，對轉染24 h后細胞中AID基因的表達情況進行了檢測。結果（圖5-A）顯示，干擾片段能將AID基因的表達量降低至原水平的5.25％，可以高效的降解目標基因mRNA，為后續研究提供良好的基礎。Western bloting結果（圖5-B）也證實轉染AID-siRNA干擾了正常AID基因的表達。

為了更好的分析AID基因對多能性基因的作用，本研究檢測了電轉染AID-siRNA 24 h后，細胞中多能性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達變化。結果（圖5-C）顯示，干擾AID的表達后，OCT4和NANOG的表達沒有變化，但是SOX2的表達量發生了明顯的降低，提示AID對SOX2的表達起著至關重要的作用。1 μmol/L 5-Aza-CdR處理AID基因敲減細胞24 h后能夠顯著提高OCT4和SOX2基因的表達（圖5-D），但是NANOG基因和AID基因的表達量沒有明顯的變化（圖5-D）。

3　討論

圖5　5-Aza-CdR處理AID基因敲減細胞對其基因表達的影響

目前認為，供體細胞在體細胞克隆過程中必然要經歷重編程的過程，而體細胞克隆效率低下和克隆動物異常的重要原因就是供體細胞錯誤的重編程或重編程不徹底［26］。而在克隆胚胎的重編程過程中DNA甲基化是很重要的事件，DNA甲基化水平的降低可以激活或促進多能基因的表達，進而改善體細胞重編程的效率［13］。目前，研究人員主要通過使用藥物改變體細胞或重構胚的表觀遺傳特性來改善體細胞重編程。5-Aza-CdR作為一種DNMT抑制劑，能夠抑制DNA的甲基化，從而降低基因組的整體甲基化水平，增強基因的表達量［16-18］。2002年，5-Aza-CdR成為美國 FDA 首批批準上市的去甲基化藥物，其主要用途就是治療MDS［27］。研究表明，使用5-Aza-CdR治療41例白血病后有一半的患者臨床癥狀減輕，通過檢測發現患者的總體基因組DNA甲基化水平明顯降低［17］。本研究檢測了5-Aza-CdR處理的轉AID基因細胞報告基因的表達、細胞周期的分布、細胞形態轉變、多能性基因的表達及其啟動子區DNA甲基化的變化，進而研究了5-Aza-CdR的整體去甲基化作用與AID的位點特異性去甲基化作用之間的關系。

本研究發現高濃度5-Aza-CdR或者是長時間的處理會明顯增加細胞的毒性，而使細胞增殖受到抑制，并阻止細胞進入DNA復制期，細胞形態扁平化類似于生長過老的細胞的狀態，此外，染色體整倍性也會發生改變。而在低濃度和短時間內處理對細胞的形態、周期和染色體倍性沒有影響。以上研究說明5-Aza具有一定的細胞毒性作用，為了能夠保證5-Aza不影響細胞的正常生長，本研究選擇用1 μmol/L 5-Aza-CdR處理細胞24 h。這樣既能保證藥物的作用效果又可以避免其對細胞的毒性損傷。

吳俠等［28］研究顯示，轉基因體細胞中報告基因的表達會隨著細胞的生長及傳代次數的增加而明顯下降，本研究也觀察到了類似的現象。有研究顯示，高濃度的5-Aza-CdR處理細胞能夠降低其基因組DNA甲基化，進而增強外源報告基因的表達［29，30］。本研究所用過表達載體pCDsRed-PbAID的報告基因（DsRed）的表達是由CMV調控的，研究顯示CMV啟動子能夠在哺乳動物體內廣泛表達。但是，進一步的觀察發現報告基因的表達隨著細胞的傳代培養被沉默［31］。通過分析CMV啟動子在轉基因細胞中其啟動子的甲基化狀態發現，其啟動子區的8個CpG位點發生甲基化［32］。本研究證實，使用5-Aza-CdR處理后轉基因體細胞基因組甲基化水平下降，報告基因的表達能夠被恢復。因而推斷，報告基因表達的下降，與CMV啟動子在傳代過程中的甲基化修飾有關。

供體細胞在受體卵母細胞胞質中不完全的重編程或錯誤重編程是導致克隆胚胎發育率低的重要原因［26］。使供體細胞的表觀遺傳特性更接近具有多能性的配子或卵裂球可能更有助于提高重編程的效率［33，34］。在豬的研究中，用5-Aza處理的細胞作為核供體，可以促進重構胚的發育［35］。在牛的研究中也有類似的發現。這些研究表明使用5-Aza處理能夠改善供體核的表觀遺傳特性從而最終提高克隆胚胎的發育率。穩定轉染AID基因的牛胎兒成纖維細胞其AID、OCT4和NANOG基因表達明顯上升。這就提示在牛胎兒成纖維細胞中AID基因可以一定程度上改善其表觀遺傳特性。由于SOX2基因沒有明顯變化，暗示AID基因的DNA去甲基化作用具有位點特異性。5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞后檢測發現OCT4和NANOG的表達量都沒有明顯的變化，但是SOX2的表達量明顯提高。此外，通過BSP的方法研究了5-Aza-CdR處理轉AID基因細胞中的OCT4、NANOG、SOX2的甲基化狀態，發現5-Aza-CdR可以降低這幾個基因的甲基化水平，尤其是SOX2 （P＜0.05）。這說明5-Aza-CdR雖然具有廣泛的DNA去甲基化作用，但是對于一些特定位點的去甲基化作用是不明顯的。我們之前的研究表明，AID基因轉入體細胞中，更有利于核移植胚胎的重編程，因而提高了體細胞克隆胚胎的卵裂率和發育率。綜合本研究5-Aza-CdR處理細胞的實驗結論，可以推測AID基因的導入和5-Aza-CdR的聯合作用，可能更有利于體細胞克隆效率的提高。

此外，為了分析5-Aza-CdR的基因組整體去甲基化與AID基因的位點特異性去甲基化之間的關系，本研究使用電轉的方法轉染AID siRNA來干擾AID基因的表達，同時使用1 μmol/L 5-Aza-CdR對轉染細胞進行處理。結果顯示，干擾AID基因后OCT4 和NANOG的表達沒有變化，但是SOX2的表達量發生了明顯的降低，而使用5-Aza-CdR能夠補償SOX2的表達。這就再一次證實了AID在哺乳動物細胞中具有DNA去甲基化作用，并且AID的DNA去甲基作用具有位點特異性。同時也說明了5-Aza-CdR的DNA去甲基化作用與AID基因的導入聯合作用，更有利于體細胞克隆效率的提高。目前研究證實AID基因可以對5mC/5hmC脫氨基，然后在如MBD4或胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA glycosylase，TDG）這些糖基化酶的作用下通過堿基切除修復（Base excision repair，BER）和錯配修復（Mismatch repair，MMR）的作用下修復T-G錯配從而最終實現DNA去甲基化［22，36］。在所有可能的AID基因去甲基化作用過程中，AID基因只是通過脫氨基作用來確定一個修飾后的堿基位點，而這一位點可能被修復復合體所錨定并修復，同時這一位點也可能不被修復復合體所識別［37］。此外，雖然現在不清楚AID基因如何選擇其靶位點，但是不可否認其選擇具有一定的特殊性［36］。這兩個原因就造成了AID基因的DNA去甲基化作用具有位點特異性。

4　結論

基因表達的調控是一個多種調節方式協同的結果，5-Aza-CdR的基因組整體去甲基化與AID基因的位點特異性去甲基化對于體細胞重編程都具有重要的作用，在特定基因位點這兩種作用可以相互補充，二者聯合處理供體細胞可能更有利于體細胞重編程效率的提高。

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（責任編輯 馬鑫）

The Effect of DNA Methyltransferase Inhibitor 5-Aza-CdR on AID Gene-modified Bovine Fetal Fibroblasts

AO Xu-dong SA Ru-la WANG Jie WANG Hui-min YU Hai-quan
（Research Center for Laboratory Animal Science Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

In order to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer，the researchers used drugs which can alter DNA methylation or histone modifications to benefit somatic cell nuclear transfer. Among them，5-aza-2'-deoxycytidine（5-Aza-CdR）blocked DNA methylation by inhibiting methyl group transfer to adenine or cytosine，and ultimately reduced genomic methylation. In this study，the AID-overexpressing and AID-knocked-down cells were used to study the effects of 5-Aza-CdR（1，2，3，4，and 5 μmol/L）on cell morphology，cell cycle，related gene expression and the changes of methylation status in the gene promoter region. Additionally，the differences between genomic DNA demethylation and site-specific DNA demethylation was analyzed，the methods and its action mechanism of increasing the reprogramming efficiency of somatic cells were discussed. Real-time PCR，BSP（Bisulfite Sequencing PCR），Western blotting，and flow cytometry were employed to analyze the effects of 5-Aza-CdR on the AID-transgenic and AID-knocked-down cells. The results showed that 5-Aza-CdR presented dose-dependent effect on AID-transgenic cells，while the 5-Aza-CdR concentration was 4 μmol/L，obvious toxicity was observed as a lot of cells were dead（P＜0.05）. When treated by 1-3 μmol/L，the cell's morphology changed，and proliferation of cells was inhibited. Karyotype analysis showed that 3 μmol/L treatments resulted in the emergence of a small proportion of aneuploidy cells，indicatingthat high concentrations of 5-Aza-CdR increased the rate of aneuploidy. The number of cells which expressed red fluorescent protein（DsRed）significantly increased after 1 μmol/L 5-Aza-CdR treatment，compared to the control group，the expression of AID and SOX2 were also increased，and the methylation levels in SOX2 promoter region were somehow decreased. After treated by 5-Aza-CdR，the expression of the OCT4 and SOX2 genes increased in AID-knocked-down cells，but the expression of the NANOG did not change. The above results revealed that 5-Aza-CdR treatment affected the cell morphology，cell cycle and reporter gene expression in bovine transgenic cells. In conclusion，while treated by 5-Aza-CdR，the genomic demethylation and loci-specific demethylation of AID act synergistically in somatic cell reprogramming.

5-Aza-CdR；AID；DNA demethylation；somatic cell nuclear transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.016

2015-10-13

國家自然科學基金項目（31460311），內蒙古自然科學基金項目（2012ZD04）

奧旭東，男，博士，研究方向：哺乳動物生殖生物學；E-mail：aoxudong_123@126.com

于海泉，男，博士，研究員，研究方向：哺乳動物生殖生物學；E-mail：haiquan_yu@yahoo.com