人乳牙牙髓干細胞全蛋白質非膠分級分離電泳分析

胡　家， 李　蕾， 王勁松， 趙君朋*

(1首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京　100069； 2首都醫科大學基礎醫學院； *通訊作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)

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人乳牙牙髓干細胞全蛋白質非膠分級分離電泳分析

胡家1， 李蕾1， 王勁松2， 趙君朋1*

(1首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京100069；2首都醫科大學基礎醫學院；*通訊作者，E-mail: jp75@mail.ccmu.edu.cn)

目的對人乳牙牙髓干細胞全蛋白質進行非膠分級分離電泳，并用液質聯用質譜分析所得蛋白質組分。方法對人乳牙牙髓干細胞進行裂解，將所得的細胞全蛋白質均分到12孔樣品槽里進行非膠分級分離電泳，液相回收電泳后的12個組分，對各組分進行SDS-PAGE分離，并對各組分進行溶液酶切后再進行液質聯用質譜分析。結果SDS-PAGE圖譜顯示人乳牙牙髓干細胞全蛋白質經非膠分級分離電泳分成了12個不同的蛋白質組分，液質聯用對各組分進行分析均成功鑒定到一定數目蛋白質。結論非膠分級分離電泳能將復雜蛋白質樣品進行預分離，液相回收分離后樣品便于進行液質聯用分析。

非膠分級分離電泳；細胞全蛋白質；液質聯用質譜；蛋白質組

蛋白質是生命活動的執行者，因此研究蛋白質組才能真正認清各種生理現象的分子機制。質譜技術是蛋白質組學的常用方法之一，通過質譜鑒定能認識某一蛋白質組的各個蛋白質組成。在進行質譜分析之前一般會對樣品進行適當分離，如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、雙向電泳、液相分離、離子交換等，每種方法均有自身的優勢及缺點，樣品分離的質量直接關系質譜檢測結果。

非膠分級分離電泳(OFFGEL electrophoresis，OGE)是在安捷倫公司生產的Agilent 3100 OFFGEL等電聚焦分級分離儀上進行，其原理是在固定pH梯度的干膠條上，根據蛋白質或多肽的等電點進行等電聚焦分離；且分離的蛋白質或多肽，最終以液相的形式加以回收。OGE對于復雜蛋白質樣品的分辨率與傳統的等電聚焦電泳(IEF)是一樣的，所不同的是分離所得各組分能液相回收，這樣便于后續的液質聯用分析[1]，而不需要切膠、提取多肽等繁瑣步驟。以往研究還發現，采用等電聚焦電泳比用陽離子交換結合反向色譜分離蛋白質樣品具有更高的分辨率[2]，并且按照等電點分離樣品之后能得出蛋白質的等電點信息，為后期的質譜鑒定結果提供驗證數據。

細胞的總蛋白質組具有寬泛的豐度范圍，而對于低豐度蛋白質的有效分離和鑒定一直是困擾人們的難題之一。本實驗對人乳牙牙髓干細胞進行裂解，將所得的細胞全蛋白質進行非膠分級分離電泳，由此將復雜蛋白質樣品按照等電點分成12份，液相回收后，對各組分進行SDS-PAGE分離，并對各組分進行溶液酶切后再進行液質聯用分析。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器

α-MEM、FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素均為Invitrogen公司產品。固相pH梯度干膠條(IPG strip pH3-10L，13 cm)、IPG緩沖液(pH 3-10的線性膠條)、覆蓋油、尿素及等電聚焦相關耗材均為Agilent公司產品，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、硫脲、SDS、甘氨酸、Tris、2D Quant蛋白定量試劑盒均為GE公司產品，胰蛋白酶為Promega公司產品，過硫酸銨、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺、考馬斯亮藍G250、三氟乙酸、甲酸為Sigma公司產品，脫鹽柱為Waters公司產品，乙腈為Fluka公司產品。等電聚焦儀OFFGEL(美國Agilent公司)；超速離心機(德國Heraeus公司)；Speed Vac真空干燥機(美國Thermo公司)；Easy-Nano LC液相色譜儀和Q-Exactive plus質譜儀(美國Thermo公司)；DU800分光光度計(德國Beckman公司)。

1.2人乳牙牙髓干細胞培養

參照文獻[3，4]的方法，乳牙牙髓取自7-8歲兒童的滯留乳中切牙(n=3)，均為男性，經臨床工作人員和患兒及其家長同意。將中段牙髓組織反復清洗，剪碎，置于含Ⅰ型膠原酶(3 g/L)和分散酶(4 g/L)的消化液中，37 ℃消化15 min，室溫1 000 r/min離心5 min，去上清，加入細胞生長培養基(α-MEM加10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，每2-3 d更換一次培養基。取3-5代細胞進行實驗。

1.3人乳牙牙髓干細胞全蛋白質制備

[5]方法對人乳牙牙髓干細胞進行蛋白質裂解，裂解液含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT及蛋白酶抑制劑(Roche，1片/10 ml)。向細胞沉淀中加入5倍體積的裂解液，渦旋均勻，置于冰上裂解細胞2 h。裂解過程中將樣品置于冰浴中超聲破碎細胞，控制超聲功率2 W，超聲時間2 s，間歇2 s，超聲至樣品溶液澄清。將樣品溶液進行高速離心，4 ℃，40 000×g離心1 h。離心結束后取上清，分裝，保存于-80 ℃，同時取5 μl×3樣品做蛋白定量用，采用GE公司2D Quant蛋白定量試劑盒對細胞全蛋白質進行蛋白質定量。

1.4細胞全蛋白質非膠分級分離電泳

細胞全蛋白質制備好后，即可進行非膠分級分離電泳。溶液配制：按照試劑盒(Agilent 3100 OFFGEL Fractionator Kit)說明配制1.25×儲液。使用時用水稀釋成1×工作液，再取200 μg細胞全蛋白質用1.25×儲液稀釋至2 ml。將聚焦槽放于非膠分級分離儀上，整個實驗過程保持水平。撕開IPG膠條的保護膜，將有凝膠一面朝上放入聚焦槽，“+”極端頂住放置固定電極一端。在膠條上放入12孔樣品槽，壓平卡住。每個樣品孔加入40 μl 1×工作液，讓膠條水化15 min。取4塊電極墊片放入1×工作液充分浸濕，緊貼樣品槽的外側兩端各放上兩片，保證墊片與凝膠之間無縫隙。上樣：每個樣品孔加入150 μl稀釋過的蛋白質樣品，蓋上密封蓋，壓平蓋緊。再取10 μl去離子水加在電極片上。最后加覆蓋油：先取200 μl加在“+”極端，1 ml加在“-”極端，過1 min后，在兩端各加入200 μl。聚焦完成后，分別取出12個樣品孔里的樣品，再每個組分取出10 μl，以及未分離細胞全蛋白質取5 μl進行SDS-PAGE分離，其余樣品用于液質聯用分析。

1.5蛋白質沉淀及酶切

將已分離的12個組分的蛋白質樣品用10% TCA/丙酮進行沉淀[7]，凍干，參照文獻[8，9]方法進行酶切。酶切反應過夜(16 h以上)進行，于次日用終濃度為0.1% TFA終止反應，然后用脫鹽柱去除雜質，最后凍干所得多肽樣品。

1.6液質聯用質譜分析

將凍干的12個組分多肽樣品重溶于0.1 %甲酸溶液，進行液相色譜-質譜聯用(Easy-Nano LC，Q-Exactive plus，Thermo)分析。液相條件：反相色譜柱采用C18柱(10 cm×75 μm，3 μm)。流動相A液為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B液為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速為300 nl/min。質譜條件：納升級電噴霧電離方式(Nano-ESI)，正離子模式掃描，碰撞能量為27%HCD，分辨率設置為一級70 000 m/z 200，二級17 500 m/z 200，母離子掃描范圍為m/z 300-1 800，子離子掃描范圍起始位m/z 100，數據依賴模式MS/MS，隔離窗口為1.6 D，動態排除為60 s；噴霧電壓為2.0 kV，毛細管溫度為275 ℃，S-lens：55%。質量數據由XCalibur軟件采集處理。

1.7質譜數據的數據庫搜索

采集的質譜數據用Proteome Discoverer1.4數據分析軟件進行序列分析。酶解位點為精氨酸(R)，賴氨酸(K)，允許有兩個漏切位點，允許一側非特異性酶解。固定修飾：半胱氨酸的carbamidomethylation。可變修飾：Oxidation/+15.995 D(M)，Deamidated/+0.984 D(N，Q)。按肽段匹配假陽性率為1%輸出搜庫結果。

2　結果

2.1細胞全蛋白質非膠分級分離電泳后進行SDS-PAGE分離

將人乳牙牙髓干細胞全蛋白質經非膠分級分離電泳后，從“+”極到“-”極各組分樣品依次標注為S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11，S12。12組分的泳道中均有蛋白質條帶(見圖1)，且各泳道蛋白質條帶有差異，相比較未進行OGE的細胞全蛋白質泳道(lysate)分離效果更好。

M.蛋白分子量標記；lysate為細胞全蛋白質；S1-S12分別表示經非膠分級分離電泳后所得的12個組分圖1　細胞全蛋白質非膠分級分離電泳后SDS-PAGE圖Figure 1　The map of SDS-PAGE of the total proteins isolated by OGE

2.2細胞全蛋白質非膠分級分離電泳所得12組分的質譜分析結果

將人乳牙牙髓干細胞全蛋白質非膠分級分離電泳所得的12個組分分別進行蛋白質沉淀、重溶后酶切、脫鹽后，進行液質聯用分析。圖2所示為其中一個組分液相基峰離子流圖(BPC)(A)、液相洗脫28.88 min時的一級質譜圖(B)及m/z709.39的二級質譜圖(C)。12個組分分別鑒定到的蛋白數見表1，從OGE時的“+”極到“-”極各組分樣品依次標注為S1-P，S2-P，S3-P，S4-P，S5-P，S6-P，S7-P，S8-P，S9-P，S10-P，S11-P，S12-P。經質譜分析各組分，發現每一組分均鑒定到一定數目的蛋白質。

3　討論

本實驗對人乳牙牙髓干細胞全蛋白質進行OGE分離，收集分離出的12個組分，進行SDS-PAGE分離，結果顯示分離效果良好，又將這12個分離所得組分酶切成多肽樣品，去雜質后，再進行液質聯用分析，共鑒定到1 798個非冗余蛋白質。非膠分級分離電泳技術對于復雜樣品進行預分離，并且能液相回收各組分，再進行質譜分析。相比采用雙向凝膠電泳技術對人乳牙牙髓干細胞全蛋白質進行分離[4]，省去了樣品等電聚焦電泳之后向二相凝膠電泳轉移的步驟，不僅操作流程更簡單，耗時少，而且杜絕了轉移過程中蛋白質丟失的可能。另外在質譜鑒定之前無需從凝膠中提取多肽，采用溶液酶切的方法能使更多多肽被質譜檢測到。

本實驗中，各組分質譜鑒定到的蛋白質數目可能受到去雜質及脫鹽步驟的影響，而使得部分蛋白未被鑒定到。如圖1、表1所示，其中S1，S2泳道的蛋白質條帶相對較少，在質譜鑒定相應組分的結果中S1-P，S2-P的蛋白質數目相對其他各組分也少一些，而S2泳道比S1泳道的蛋白質條帶明顯，但其質譜鑒定的蛋白質數目并不相符。因此還需對去雜質脫鹽步驟進行優化。

OGE適用于多種來源的復雜蛋白質樣品，如組織、細菌、亞細胞蛋白質組[1,10,11]，分泌蛋白[12,13]，血清[14]等等。該技術既可用于分離蛋白質樣品也可分離多肽樣品，Uzozie等[15]對大腸腺瘤組織和正常腸黏膜組織及相關細胞系的總蛋白質進行酶切，之后采用穩定同位素8標試劑盒對樣品進行標記，再用OGE分離多肽樣品，經液質聯用測試分析后，最終在組織里鑒定到4 325種非冗余蛋白質，在細胞中鑒定到2 017種非冗余蛋白質。在國內開展此項分離技術的實驗室還不多，李賢煜等[9]以肝癌細胞系MHCC97L的無血清培養分泌蛋白質為研究對象，將分泌蛋白質酶切所得肽段進行OGE分離，再經液質聯用鑒定了2 995個蛋白質。

圖2　液質聯用分析其中一個組分所得液相BPC圖(A)、液相洗脫28.88 min時的一級質譜圖(B)及m/z 709.39的二級質譜圖(C)Figure 2　BPC diagram of one of the separated proteins from OGE(A), MS diagram at elution time of 28.88 min(B), and MS/MS diagram at m/z of 709.39(C) in LC-MS/MS

表1OGE各組分鑒定的蛋白質數目

Table 1Numbers of unique proteins in 12 fractions identified by OGE

樣品編號鑒定蛋白個數樣品編號鑒定蛋白個數樣品編號鑒定蛋白個數S1-P148S5-P521S9-P235S2-P73S6-P652S10-P433S3-P266S7-P406S11-P348S4-P276S8-P420S12-P345

OGE與各種標記方法、液質聯用、親和富集和凝膠分析等上下游處理方法兼容，體現了該分離方法具有極強的靈活性。并且分離重復性好，可重復實驗收集某一個組分的樣品，從而富集該pH范圍的低豐度蛋白質(或多肽)尤其便于對低豐度蛋白質進行分析，如各種細胞因子，血清去高豐度蛋白之后樣品，細胞或組織分泌蛋白質組等等，用常規分離技術很難研究的樣品，采用該技術進行分離、富集，從而為后續研究打下基礎。

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Analysis of the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis

HU Jia1, LI Lei1, WANG Jinsong2, ZHAO Junpeng1*

(1MedicalExperimentandTestCenter,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2CapitalMedicalUniversitySchoolofBasicMedicalSciences;*Correspondingauthor,E-mail:jp75@mail.ccmu.edu.cn)Abstract：ObjectiveTo isolate and identify the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth by OFFGEL electrophoresis and liquid chromatography with mass spectrometry(MS).MethodsThe total cell proteins were extracted from stem cells from human exfoliated deciduous teeth, and assigned into 12 sample wells for OFFGEL electrophoresis(OGE). The 12 protein fractions were obtained by liquid recovery, then isolated by SDS-PAGE and digested to the peptides, and finally identified by nano liquid chromatography-electrospray ionization-MS/MS(LC-ESI-MS/MS).ResultsThe map of SDS-PAGE revealed that the total cell proteins of stem cells from human exfoliated deciduous teeth were composed of 12 different fractions after OGE. A number of proteins from the 12 fractions were successfully identified by nano LC-ESI-MS/MS.ConclusionThe complex protein samples can be isolated, and the separated proteins are easy to be identified by LC-MS/MS.Key words:OFFGEL electrophoresis;total cell proteins;LC-MS/MS;proteome

首都醫科大學科研基金資助項目(校技術類2014JS04)

胡家,女,1981-06生,碩士,主管技師,E-mail:hujia413@163.com

2015-12-22

Q503

A

1007-6611(2016)03-0250-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.013