三維培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的研究

翟莎菲， 蔣文凱， 倪龍興*

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安　710021； 2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院； *通訊作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com； #共同通訊作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)

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三維培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的研究

翟莎菲1#， 蔣文凱2， 倪龍興2*

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安710021；2第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；*通訊作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com；#共同通訊作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)

目的檢測普通貼壁培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞在一定時(shí)間的增殖能力。方法用U底鋪有瓊脂糖的96孔板作為非黏附表面，每孔接種104個(gè)牙髓細(xì)胞形成三維培養(yǎng)體系，誘使牙髓細(xì)胞發(fā)生 nemosis。以普通貼壁培養(yǎng)牙髓細(xì)胞作為對(duì)照組，分別在細(xì)胞接種20，40，60，80 h加入CCK8試劑，450 nm校正波長測量光密度(OD)值。 結(jié)果隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，普通貼壁培養(yǎng)牙髓細(xì)胞OD值逐漸增多；三維培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的OD值不同，其中三維培養(yǎng)20-60 h OD值變化不大，80 h較60 h OD值顯著減少；并且在不同的時(shí)間點(diǎn)，三維培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞的OD值均小于普通貼壁培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，三維培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞細(xì)胞增殖能力均小于貼壁培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞。

牙髓細(xì)胞；三維培養(yǎng)；增殖活力；nemosis

牙髓成纖維細(xì)胞是牙髓組織的主體細(xì)胞，因此又被稱為牙髓細(xì)胞。以往的研究認(rèn)為牙髓細(xì)胞負(fù)責(zé)合成胞外基質(zhì)，近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)牙髓細(xì)胞在牙髓組織免疫反應(yīng)以及牙髓炎的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[1,2]，但牙髓細(xì)胞參與牙髓炎癥的免疫防御機(jī)制尚不清楚。近年來，一種被稱為“nemosis”的發(fā)生在成纖維細(xì)胞上的細(xì)胞激活形式被國內(nèi)外研究所發(fā)現(xiàn)。Bizik等[3]發(fā)現(xiàn)利用三維培養(yǎng)的方法使得成纖維細(xì)胞之間形成緊密接觸，能使其激活，隨著自發(fā)性地釋放一系列的細(xì)胞因子，如促炎因子(IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF)和趨化因子(MIP-1α、RANTES、IL-8)，與此同時(shí)，成纖維細(xì)胞自身逐漸開始發(fā)生壞死，具有程序性壞死的特征，因此取名“nemosis”，希臘語意為“不可避免的報(bào)復(fù)”[3-6]。利用體外三維培養(yǎng)使得成纖維細(xì)胞自發(fā)性激活nemosis，可能為研究炎癥發(fā)生和保持以及炎癥相關(guān)致癌作用提供新思路[5]。迄今為止，發(fā)生nemosis的細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)的有包皮成纖維細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等，但牙髓成纖維細(xì)胞能否發(fā)生nemosis，有何自有的特征，至今研究很少[4,7]。本實(shí)驗(yàn)比較研究牙髓細(xì)胞增殖能力在非黏附不貼壁的三維培養(yǎng)體系中和普通貼壁培養(yǎng)體系中有何不同，為下一步搞清nemosis這種炎性細(xì)胞死亡在牙髓炎中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)液(Gibico，美國)；胎牛血清(Sigma，美國)；胰蛋白酶(Invitrogen，美國)；青霉素、鏈霉素(Invitrogen，美國)；瓊脂糖(BioWhittaker，美國)；CCK-8試劑(DOJINDO，日本)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國)。

1.2人牙髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，經(jīng)患者知情同意，取第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院頜外門診拔除的健康(無齲壞、牙髓炎或牙周炎)第三磨牙，患者年齡15-25歲，參照文獻(xiàn)[8]方法，用含雙抗的PBS液反復(fù)清洗牙齒后，無菌條件下分離牙髓，根尖1/3部分剪棄，剩余牙髓剪成約1.0 mm3的碎塊，平鋪于孔板底壁滴加有500 μl含20%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液的6孔板內(nèi)，用無菌蓋玻片小心覆蓋組織塊使之固定，緩慢輕輕加入上述培養(yǎng)液2 ml，置培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng),每3 d換液1次，待細(xì)胞生長會(huì)合后，20 g/L胰蛋白酶消化原代細(xì)胞，按1∶3傳代，取4-6代細(xì)胞用于后述實(shí)驗(yàn)。

1.3牙髓細(xì)胞的三維培養(yǎng)及形態(tài)觀察

蒸餾水配制0.8%的瓊脂糖溶液，高壓滅菌后鋪于U形底的96孔板形成非黏附表面。20 g/L胰蛋白酶消化牙髓細(xì)胞，用含10%胎牛血清的α-MEM制備5×104/ml的細(xì)胞懸液，接種于U形96孔板，每孔200 μl，置培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2的孵箱,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4牙髓細(xì)胞增殖能力檢測

消化牙髓細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后等量接種于平底96孔板和U型底96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞接種的20，40，60，80 h加入待檢測孔，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液1/10體積的CCK8試劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm測量波長，650 nm校正波長測吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1三維培養(yǎng)牙髓細(xì)胞形態(tài)

三維培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞2 h即可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始聚集，12 h時(shí)細(xì)胞和細(xì)胞之間距離更近，20 h左右即可形成類似“球體”，細(xì)胞球體內(nèi)細(xì)胞之間連接緊密，普通的方法甚至胰酶都很難使其解體，大約48 h后細(xì)胞球體體積進(jìn)一步縮小，與此同時(shí)球體周圍可見細(xì)胞碎片殘骸。

圖1　光鏡下三維培養(yǎng)40 h牙髓細(xì)胞(×40)Figure 1　Dental pulp cells morphology in three-dimensional culture at 40 h under optical microscope

2.2牙髓細(xì)胞胞膜損傷檢測

CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2，實(shí)驗(yàn)所測的光密度值的大小代表細(xì)胞數(shù)目多少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，普通貼壁培養(yǎng)牙髓細(xì)胞OD值逐漸增多；而三維培養(yǎng)20，40，60，80 h不同時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異(P=0.042)，其中20 h，40 h，60 h OD值變化不大，80 h較60 h OD值顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。

與普通貼壁比較，*P<0.05;與60 h比較，#P<0.05圖2　貼壁培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞細(xì)胞增殖能力Figure 2　Comparison of dental pulp cells proliferation abilities between three-dimensional culture and normal adherent culture

3　討論

CCK8試驗(yàn)是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。CCK8試劑通過測量細(xì)胞代謝體現(xiàn)細(xì)胞活力，檢驗(yàn)細(xì)胞增殖能力。CCK8試劑中含有WST-8，其能通過電子載體的作用進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過線粒體的脫氫酶還原反應(yīng)生成黃色甲臜染料，生成甲臜染料的數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量呈正比，染料是水溶性的，因此不需要裂解細(xì)胞，因此可直接比色檢測，用于細(xì)胞增殖的檢測。傳統(tǒng)的檢測細(xì)胞生長所用的顯色劑是四唑鹽，商品名是噻唑藍(lán)，簡稱為MTT。MTT法檢測原理是：活細(xì)胞線粒體中存在琥珀酸脫氫酶，因此能使外源性的MTT還原為不溶性的甲臜藍(lán)紫色結(jié)晶物，進(jìn)而沉積在細(xì)胞中。而死細(xì)胞不存在琥珀酸脫氫酶，還原后的甲臜是非水溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，因此，MTT法較適宜普通貼壁細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖活力。但對(duì)本研究的三維懸浮培養(yǎng)體系來說，操作繁瑣，重復(fù)性差，而且工作量比較大。因此本實(shí)驗(yàn)選擇CCK8法同時(shí)普通貼壁和三維培養(yǎng)這兩種不同培養(yǎng)體系中牙髓細(xì)胞增殖能力。

成纖維細(xì)胞發(fā)生nemosis的特點(diǎn)是形成“球形”細(xì)胞聚集體的同時(shí)細(xì)胞開始逐步壞死。與細(xì)胞凋亡相比，nemosis不具有凋亡相關(guān)分子(如Fas、Daxx、caspase-3)激活和DNA斷裂，并且細(xì)胞發(fā)生nemosis能促使多種促炎因子的生成，因此，nemosis有別于經(jīng)典的細(xì)胞凋亡[3,11,12]。本研究以普通貼壁培養(yǎng)牙髓細(xì)胞作為對(duì)照組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組OD值逐漸增多；由于吸光度值的大小代表細(xì)胞數(shù)目多少，因此說明普通貼壁培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長細(xì)胞數(shù)逐漸增多，并從快速增長逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。以往的研究認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞受到外界物理或化學(xué)性的損傷因子，缺氧以及營養(yǎng)不良等作用下會(huì)使細(xì)胞增殖能力受到影響。本研究觀察到在三維培養(yǎng)發(fā)生nemosis的牙髓細(xì)胞中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OD值逐漸減少，說明發(fā)生nemosis能使得牙髓細(xì)胞增殖能力在一定程度上受損。三維培養(yǎng)牙髓細(xì)胞形成“球狀”細(xì)胞聚集體，進(jìn)而細(xì)胞增殖能力在一段時(shí)間內(nèi)受到抑制。這一改變的激發(fā)因素不是由于任何外界毒力刺激，僅是由細(xì)胞聚集所引起的。牙髓細(xì)胞和細(xì)胞之間的緊密接觸導(dǎo)致細(xì)胞代謝活力下調(diào)，可能暗示細(xì)胞與細(xì)胞之間存在接觸抑制—一種在普通貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中的現(xiàn)象[13]。今后進(jìn)一步對(duì)牙髓細(xì)胞nemosis損傷機(jī)制的研究將有助于揭示這種細(xì)胞激活形式在牙髓組織炎性反應(yīng)中作用。

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Study on proliferation abilities ofinvitrothree-dimensional cultured human dental pulp cells

ZHAI Shafei1#，JIANG Wenkai2，NI Longxing2*

(1DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China；2DepartmentofOperativeDentistryandEndodontics，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail:Longxing_Ni@hotmail.com；#Co-correspondingauthor，E-mail:zhaishafei@xiyi.edu.cn)

ObjectiveTo compare the difference of proliferation abilities between normal adherent cultured dental pulp cells and three-dimensional cultured dental pulp cells.MethodsThe formation of nemosis was initiated by seeding 104dental pulp cells in one well of a U-bottomed, 96-well plate coated with agarose. The normal adherent cultured dental pulp cells in flat bottomed 96-well plate were used as control group. At 20 h，40 h，60 h，80 h after cell seeding, the CCK8 reagent was added. The optical density(OD) values were measured at a wavelength of 450 nm.ResultsOD values gradually increased in the adherent cultured dental pulp cells during the cell culture. In the three-dimensional cultured dental pulp cells，OD values showed no significant change from 20 h to 60 h, but decreased significantly at 80 h after cell seeding(P<0.05). Compared with dental pulp cells in the normal adherent culture, the OD values in the three-dimensional cultures were decreased at each time point(P<0.05).ConclusionThe proliferation ability in the three-dimensional cultured dental pulp cells are weaker than that of normal adherent cultured dental pulp cells.

dental pulp cells；three-dimensional culture；proliferation ability；nemosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371139,81170946);陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(2015SF157)；西安醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(2015DC21)

翟莎菲，女，1983-08生，博士，講師，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn

2015-11-27

R781

A

1007-6611(2016)03-0247-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.012