Wilson病銅過量負荷大鼠肝損傷的代謝組學研究

蔣懷周， 王　鍵， 許晶晶， 董繼揚

(1安徽中醫藥大學中醫臨床學院中醫基礎理論教研室，合肥　230031； 2廈門大學電子科學系，福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室)

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Wilson病銅過量負荷大鼠肝損傷的代謝組學研究

蔣懷周1， 王鍵1， 許晶晶2， 董繼揚2

(1安徽中醫藥大學中醫臨床學院中醫基礎理論教研室，合肥230031；2廈門大學電子科學系，福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室)

目的利用代謝組學技術研究銅負荷大鼠肝組織的小分子變化，探討銅過量對肝臟小分子代謝的影響。方法16只Wistar大鼠隨機分為正常組和模型組，以銅負荷法造模，通過核磁共振氫譜技術采集大鼠肝組織的代謝輪廓，以PLS-DA方法分析銅中毒后，大鼠肝組織代謝物的變化。結果與正常組對比，模型組大鼠肝組織中尿素囊、?；撬?、肌醇、賴氨酸、尼克酰胺、乙醇胺、乙酸、谷氨酸、酪氨酸、尿苷、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、3-羥基丁酸、纈氨酸、乳酸、亮氨酸、苯丙氨酸、N-乙酰天冬氨酸、延胡索酸和腺苷/肌苷的含量升高(P<0.05)，肌酸、天冬酰胺、天冬氨酸、磷酸膽堿和甘露醇的含量降低(P<0.05)。結論銅對大鼠肝組織的損傷可能涉及鳥氨酸和三羧酸循環、磷脂、氨基酸、能量、核苷酸和糖的代謝。

Wilson?。桓味範詈俗冃?；代謝組學；銅負荷；核磁共振氫譜；肝損傷

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，由英國神經病學家Samuel Alexander Kinnier Wilson在1912年首次描述，又稱肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration，HLD)。WD的病理過程是過量的銅沉積于肝臟，當肝內銅飽和后，銅繼續在腦、骨、腎臟、角膜等其他組織器官沉積，引發一系列損傷和相應臨床表現[1]。肝臟是WD最早也是最主要的受累器官，肝損傷是多數WD患者的首發癥狀，其損害程度與本病預后密切相關，也是導致該病患者死亡的重要因素[2]。因此，研究銅對肝的損傷機制，對于探討WD肝損傷及其治療具有一定的意義。

代謝組學是系統生物學的一個重要組成部分，它是研究生理、病理或者藥物等刺激下生物體代謝物的變化，可廣泛應用于生物醫學的諸多領域。前期研究發現，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)代謝組學技術可篩選出與銅負荷大鼠模型相關的差異代謝物[3]，在探索銅過量對機體毒理方面具有良好的應用前景。肝臟是機體物質代謝的中樞器官，也是銅代謝和沉積所涉及的重要器官。本實驗通過對銅負荷大鼠肝組織的代謝組學分析，探討銅負荷對肝組織的小分子代謝影響，期望能對WD肝損傷機制及其治療提供一定的研究思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物

12周齡雄性SPF級Wistar大鼠16只，體質量(180±20)g，實驗動物許可證號：SCXK(皖)2011-002，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，飼養于安徽中醫藥大學省部共建教育部重點實驗室。

1.2主要試劑與儀器

硫酸銅(分析純,上海國藥集團)；蘇木精(上?；瘜W試劑公司)；伊紅(上?；瘜W試劑公司)；乙醚(分析純,上海蘇懿化學試劑有限公司)；TUNEL試劑盒(10279600，美國Roche公司)；甲醇(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)；三氯甲烷(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。

Bruker 600 MHz核磁共振譜儀(Bruker-AV600 spectrometer，德國Bruker公司)；全自動生化分析儀(Olmpus AU2700，日本Olympus公司)；病理圖像分析儀(HPIAS-1000，武漢清平影像技術有限責任公司)；高通量組織研磨器(SCIENTZ-48，寧波新芝生物科技股份有限公公司)；冷凍干燥機(北京博醫康試驗儀器有限公司)。

1.3銅負荷大鼠模型的建立及樣本采集

適應性飼養1周后，大鼠被隨機分為正常組和模型組，每組8只。飼養環境：室溫20-22 ℃，相對濕度40%-60%，光照12 h、黑暗 12 h。正常組始終自由攝食基礎飼料、飲用自來水；模型組以銅負荷法[3]造模，具體方法為：連續12周喂飼含硫酸銅的飼料(1 g/kg)和水(0.185%)。

造模結束，大鼠禁食12 h，乙醚吸入麻醉，腹主動脈采血，用于血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)檢測；取新鮮肝組織分為兩份，一份置于液氮快速冷凍，以超低溫冰箱(-80 ℃)保存，用于NMR檢測，另一份以10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，用于肝組織病理和細胞凋亡檢測。

1.4血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶檢測

由全自動生化分析儀檢測。將儀器比色參數設置為主波長340 nm，副波長405 nm。檢測血清ALT時，取12 μl血清樣品與試劑1(α-酮戊二酸65 mmol/L+還原型輔酶Ⅰ 0.37 mmol/L)混勻，37 ℃恒溫靜置5 min，加入試劑2(L-丙氨酸0.9 mol/L+乳酸脫氫酶25 kU/L)，混勻，延遲1 min后，測第一測光點，溫浴3-4 min，測第二測光點。測血清AST時，除試劑2為L-天門冬氨酸1.0 mmol/L+蘋果酸脫氫酶5 kU/L，其余參數及步驟與測血清ALT相同。

1.5肝組織病理學檢查

將甲醛固定的待測組織乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟過夜；石蠟包埋并切片；切片脫蠟至水，蘇木精染色，分化，PBS藍化；伊紅染色；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察結果并攝片。

1.6肝組織細胞凋亡實驗

以Roche公司原位細胞凋亡檢測盒說明書操作實驗過程。結果判定：陽性肝細胞核染色呈棕褐色，陰性肝細胞核染色呈藍色。根據隨機拍取的肝細胞TUNEL染色照片，光鏡下(400倍)用單盲法計數，計算肝細胞凋亡指數(apoptosis index, AI)。具體計算方法為:AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.7核磁共振氫譜技術采集大鼠肝組織的代謝輪廓

肝組織組織提?。喝「谓M織樣品置于由甲醇和蒸餾水配置的溶液里，4 ℃勻漿；加入氯仿(1.4 ml)，漩渦樣品；加入蒸餾水(0.7 ml)，再漩渦樣品；4 ℃離心樣品(10 000 r/min×10 min)；將離心所得上清液移至離心管；真空干燥揮發甲醇；剩余溶液凍干成粉末狀。

肝組織氫譜采集：將凍干粉加入重水配置的550 μl磷酸鹽緩沖液里，震蕩混勻；4 ℃離心10 min(10 000 r/min)，以移液槍將上清液(500 μl)移至核磁管，樣本采集于Bruker 600 MHz核磁共振譜儀完成，使用標準的預飽和脈沖序列ZGPR(RD-90°-ACQ)采集1H-NMR譜，實驗溫度296 K，譜寬12 kHz，弛豫延時長2 s，采樣點數32 000，累加次數64次。

氫譜數據處理：MestreNova 9.0軟件將fid數據傅里葉變換成NMR譜。將TSP譜峰為零點定標NMR譜，對所得NMR譜進行相位校正和基線校正。以自編軟件[4]進行譜峰對齊，截除殘余水信號和甲醇信號(分別為：δ5.23-4.68和δ3.40-3.31)，自適應分段積分[5]剩余區域，對數據進行概率商歸一化(probabilistic quotient normalization，PQN)[6]。最后導入SIMCA-P軟件(version 14.0，Umetrics，Sweden)進行多變量分析。

1.8統計學分析

2　結果

2.1大鼠一般狀態觀察

正常組大鼠生長狀態未見明顯改變；模型組大鼠組于造模過程中逐漸出現食欲減退、毛發蓬松、光澤度差、精神萎靡、腹瀉、對外界刺激反應減弱等狀態改變。

2.2血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶變化

與正常組相比，造模6周后模型組大鼠血清AST和ALT水平顯著升高(P<0.01，見表1)。

2.3肝組織病理學變化

HE染色結果顯示，正常組大鼠的肝細胞大小基本相同、界限明顯，圍繞中央靜脈和匯管區呈有序排列，肝小葉結構清晰(見圖1A)；與正常組相比，模型組大鼠肝細胞之間界限不清，細胞核固縮，肝小葉結構較紊亂(見圖1B)。

表1銅負荷造模6周后兩組大鼠血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平比較

Table 1Comparison of serum AST and ALT levels after copper overload for 6 weeks between the two groups

組別nALT(U/L)AST(U/L)正常組637.22±4.77120.53±16.79模型組670.31±11.17△201.92±21.60△

與正常組比較，△P<0.01

2.4肝組織細胞凋亡實驗結果

如圖2所示，正常組大鼠肝組織僅可見少數、散在凋亡細胞(見圖2A)，細胞凋亡指數為10.38±3.49；模型組較正常組凋亡細胞增多(見圖2B)，細胞凋亡指數為65.84±7.15。與正常組相比，模型組大鼠細胞凋亡指數顯著增高(P<0.01)。

A.正常組　　　　　　　　　　　　　　B.模型組圖1　銅負荷造模6周后兩組大鼠肝組織形態學變化 (HE染色，×400)Figure 1　Morphologic changes of rat liver tissues after copper overload for 6 weeks in the two groups (HE staining，×400)

A.正常組　　　　　　　　　　　　　　B.模型組圖2　銅負荷造模6周后兩組大鼠肝組織細胞凋亡 (TUNEL，×400)Figure 2　Apoptosis of rat liver tissue cells after copper overload for six weeks in the two groups (TUNEL，×400)

2.51H-NMR代謝輪廓分析結果

本實驗兩組大鼠肝組織典型1H-NMR譜見圖3。由于樣品譜圖低場部分信號強度較低，我們將譜圖放大15倍顯示,并根據HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca)和相關文獻[7，8]，對強度較高的譜峰進行代謝物歸屬。

為了尋找正常組和模型組之間代謝物的差異，我們對譜圖進行偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriminate analysis,PLS-DA)，結果見圖4。PLS-DA得分圖(4A)中，每一個點代表一個肝組織樣品，正常組和模型組分別處于圖4A不同的區域，可明顯區分，說明它們之間存在代謝差異。其中，正常組樣品較為分散，可能是自由飲食大鼠個體差異較大所致。為驗證正常組和模型組之間是否存在顯著差異，我們對PLS-DA模型進行200次的排列實驗，結果見圖4B，驗證通過，模型有效。

ADP:二磷酸腺苷；Ino:肌苷；Ade:腺嘌呤核苷；Ads：腺苷；α-Glu：α-葡萄糖；β-Glu：β-葡萄糖；EA：乙醇胺；Tau：?；撬?；Glu：谷氨酸；Ala：丙氨酸；NA：煙堿；Phe：苯丙氨酸；Tyr：酪氨酸；Fum：延胡索酸；AMP：單磷酸腺苷；All：尿素囊；Lac，乳酸；Cr：肌酸；GPC：甘油磷酸膽堿；PC：磷酸膽堿；Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺；Ace：乙酸；Eth：乙醇；Val：纈氨酸;m-I:肌醇圖3　銅負荷造模6周后兩組大鼠肝組織樣品典型1H-NMR譜Figure 3　Typical 1H-NMR spectra of rat liver tissues in the two groups after copper overload for 6 weeks

A.PLS-DA得分圖(正常組，模型組)　　　　　　　　　B.PLS-DA模型驗證(正常組-模型組)圖4　兩組大鼠肝組織樣品1H-NMR譜PLS-DA分析圖Figure 4　PLS-DA analysis result of 1H-NMR spectra of rat liver tissues in the two groups

根據模型變量的VIP值和t檢驗結果，篩選出對組間區分貢獻較大的代謝物(見圖5)。銅負荷所致大鼠肝組織小分子變化包括尿素囊、?；撬帷⒓〈?、賴氨酸、尼克酰胺、乙醇胺、乙酸、谷氨酸、酪氨酸、尿苷、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、3-羥基丁酸、纈氨酸、乳酸、亮氨酸、苯丙氨酸、N-乙酰天冬氨酸、延胡索酸、腺苷/肌苷含量升高，肌酸、天冬酰胺、天冬氨酸、磷酸膽堿、甘露醇含量降低。

3　討論

銅是人類必需的微量元素，分布于人體各組織器官，參與造血、代謝、生長發育等多種生理功能。正常情況下銅自腸道被吸收，大部分被肝細胞攝取。在肝細胞內，β多肽銅轉運ATP酶[9](ATPase Cu2+transporting beta polypeptide，ATP7B )將銅與前銅藍蛋白結合成銅藍蛋白并釋放入血，循環中90%的銅以銅藍蛋白形式存在；肝細胞含銅過多時，銅可在ATP7B蛋白作用下隨膽汁排出。WD患者因ATP7B基因突變，導致銅藍蛋白合成異常、膽汁排銅障礙，過量的銅沉積于肝臟，造成肝細胞凋亡、壞死等損傷，臨床可表現為急、慢性肝炎，肝纖維化等[2,10]。由于本病臨床表現復雜多樣，目前尚無任何一種動物模型可復制其全部臨床特征，但已證實，銅負荷飲食可在大鼠肝、腦、腎、骨等組織器官產生類似于WD的銅沉積，常用于WD銅損傷及藥物治療機制的研究[3,11,12]。本實驗模型組大鼠AST和ALT升高，肝組織發生病理學改變，肝細胞凋亡指數增高。模型組與正常組大鼠肝組織樣品在PLS-DA得分圖上可明顯區分，提示正常組和模型組之間存在代謝差異，且銅對模型組大鼠肝臟具有一定的損傷。

1.3-羥基丁酸；2.乳酸；3.賴氨酸；4.苯丙氨酸；5.N-乙酰天冬氨酸；6.纈氨酸；7.異亮氨酸；8.腺苷/肌苷；9.亮氨酸；10.磷酸膽堿；11.延胡索酸；12.天冬氨酸；13.尿素囊；14.肌酸；15.?；撬?；16.肌醇；17.尼克酰胺；18.乙醇胺；19.天冬酰胺；20.乙酸；21.谷氨酸；22.酪氨酸；23.尿苷；24.甲硫氨酸；25.蘇氨酸；26.甘露醇圖5　銅負荷造模6周后兩組大鼠肝組織樣品相比較的差異代謝物Figure 5　Differences of metabolites of rat liver tissues between the two groups after copper overload for six weeks

前期研究證實，銅離子主要通過活性氧族介導的氧化應激，引起線粒體膜通透性增加，導致細胞凋亡[2]。肝細胞受損后，胞內的轉氨酶可大量釋放入血，造成血清轉氨酶如AST、ALT的升高。磷脂是線粒體膜、細胞膜等生物膜的重要組成部分，對于維持線粒體和細胞功能起著重要作用，乙醇胺、肌醇、磷酸膽堿參與磷脂代謝[13]，尼克酰胺是維生素PP的一種，可通過增加線粒體能量底物NAD+和 NADP+的合成，減少活性氧族的產生，穩定線粒體膜結構，實現抗氧化和凋亡[14]。本實驗模型組大鼠以上代謝物含量皆發生改變，說明銅對肝細胞膜性結構的損傷，可能涉及這些小分子代謝的異常。

肝臟在機體某些代謝中起著獨特的作用，是其他器官所不能取代的。比如，經鳥氨酸循環將氨合成無毒的尿素排出體外，即是肝特有的功能。以肝損傷為主要表現的肝型WD患者，隨著肝臟受損程度的加重，鳥氨酸循環不能正常進行，可出現血氨增高，肝性腦病的表現[2]?；蚪M學和蛋白質組學發現，銅損傷大鼠肝臟時，與三羧酸循環和鳥氨酸循環密切相關的基因、蛋白質發生了一定改變[15]。這兩個循環通過延胡索酸和天冬氨酸相連，且此處的天冬氨酸由谷氨酸轉氨基作用生成。本實驗模型大鼠肝組織這三種氨基酸含量改變，可能提示銅損傷肝臟時，鳥氨酸循環和三羧酸循環的連接環節發生了變化，或可為今后研究肝損傷與鳥氨酸循環和三羧酸循環的聯系提供一定的線索。

肝臟富含參與氨基酸代謝的酶類，氨基酸的分解、合成在肝內十分活躍。苯丙氨酸和酪氨酸屬于芳香族氨基酸，在肝中代謝分解；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸為支鏈氨基酸，由胰島素促進其進入骨骼肌分解，而胰島素由肝臟滅活。肝損傷時，不能正常代謝芳香族氨基酸、滅活胰島素，以上氨基酸代謝可發生異常。在同樣是金屬中毒的研究中發現，支鏈氨基酸的含量有所變化[16,17]，而芳香族氨基酸含量的改變常見于肝損傷[18,19]。本研究結果與之相符合，說明銅損傷肝臟與支鏈氨基酸和芳香族氨基酸的變化可能具有一定聯系。

此外，肌酸主要由甲硫氨酸提供甲基在肝臟合成，它是儲存能量的重要化合物，被認為是評估肝損傷的一個重要指標[20]；腺苷/肌苷、尿素囊、尿苷為核苷酸代謝的重要產物；銅可影響有氧氧化過程，使無氧代謝增加，糖酵解最終產物乳酸含量可因此升高。以上小分子含量均在模型組大鼠肝組織發生了變化，提示銅過量可導致肝組織能量、核苷酸和糖代謝發生一定的失調。

肝臟是機體最大的腺體、代謝最活躍的器官，它整合、調節機體各代謝途徑，在代謝過程中發揮著關鍵的作用。本實驗以核磁共振代謝組學技術分析了銅負荷大鼠肝組織樣本，初步鑒定了銅對大鼠肝損傷的一些小分子代謝物，分析認為這些小分子變化可能涉及鳥氨酸和三羧酸循環、磷脂、氨基酸、能量、核苷酸和糖代謝，可為今后研究銅對WD肝損傷的機制提供一些參考。

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Research on metabolomics of liver injury rats with Wilson’s disease due to copper overload

JIANG Huaizhou1, WANG Jian1, XU Jingjing2, DONG Jiyang2

(1TeachingandResearchOfficeofBasicTheoryofTraditionalChineseMedicine,SchoolofTraditionalChineseMedicine,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031,China;2FujianProvincialKeyLaboratoryofPlasmaandMagneticResonance,DepartmentofElectronicScience,XiamenUniversity)

ObjectiveTo explore the changes of small molecules in liver tissues of rats with copper overload and the influences of copper overload on metabolism of small molecules in liver tissues.MethodsSixteen Wistar rats were randomly divided into normal control group and model group. Copper overload method was used to establish the model rats.1H-NMR was used to acquire the metabolic profile of rat liver tissues, and PLS-DA was used to analyze the changes of metabolites in rat liver tissues after copper poisoning.ResultsCompared with normal control group, the contents of allantoin, taurine, myoinositol, lysine, nicotinamide, ethanolamine, acetate, glutamate, tyrosine, uridine, methionine, threonine, isoleucine, 3-hydroxybutyrate, valine, lactate, leucine, phenylalanine, N-acetylaspartate, fumarate, and adenosine/inosine were increased(P<0.05), while the contents of creatine, asparagine, aspartate, phosphorylcholine and mannitol were decreased in model group(P<0.05).ConclusionCopper damage in rat liver tissues may be involved in the metabolism of ornithine and Krebs cycles, lecithin, amino acid, energy, nucleotides and glucose.

Wilson’s disease;hepatolenticular degeneration;metabonomics;copper overload;1H-NMR;liver damage

國家自然科學基金青年基金資助項目(81202691)；安徽省高校自然科學基金重點基金資助項目(KJ2012Z228)；安徽中醫學院自然科學基金資助項目(2011ZR008B)；安徽省高校博士后崗位項目基金資助項目;安徽省高校優秀青年骨干教師國外訪問研修重點項目(gxfxZD2016121)

蔣懷周，女，1978-01生，博士，講師，E-mail：jhzlindq@hotmail.com

2015-11-22

R596

A

1007-6611(2016)03-0199-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.002