海洋真菌BH0531代謝產物對感染根結線蟲黃瓜保護酶的影響

蔡 爽，劉曉霞，申佩娟，黃 敏，孟慶恒，孫建華

（1.天津師范大學生命科學學院 天津 300387； 2.天津市動植物抗性重點試驗室 天津 300387）

根結線蟲（Meloidogynespp．）是一種內源固著性寄生線蟲，是危害世界農業(yè)生產的主要病原物之一[1-2]。根結線蟲的入侵會使植物膜系統(tǒng)受損從而導致傷害產生，此時，植物細胞中的防御酶發(fā)揮作用，對線蟲脅迫產生生理生化響應[3]。防御酶系統(tǒng)主要包括 SOD、POD、CAT、PAL、PPO 等，它們參與植株體內的活性氧代謝，能夠直接殺死、抑制病原物生長發(fā)育等[4]。例如，在根結線蟲脅迫條件下細胞內產生的活性氧簇能夠有效地啟動黃瓜植株抗氧化酶系統(tǒng)[5]，而SOD、POD和CAT是植物體內主要的抗氧化酶，能夠響應各種逆境因子造成的氧化脅迫[6]。POD和CAT在保護酶中主要起到酶促降解過氧化氫的作用，POD是防止膜脂過氧化的主要酶，CAT對細胞內組分活性狀態(tài)有重要的保護作用[3]；PAL是植株體內苯丙烷代謝途徑的關鍵限速酶，其活性的高低決定了植株體內多種次生酚類化合物、木質素、植保素、類黃酮等抗菌物質的合成效果，因而PAL在植物抗病代謝和次生代謝中均具有重要作用[7]。林文雄等[8]認為逆境脅迫下，葉片的脂膜透性增加，相對電導率增加，SOD、CAT和POD等保護性酶的活性降低，使保護性物質類胡蘿卜素含量降低，MDA含量增加，膜脂過氧化作用增強。李淑菊等[9]在水楊酸對黃瓜幾種酶活性及抗病性的誘導作用的研究中，發(fā)現(xiàn)水楊酸處理黃瓜后其體內PPO、POD和PAL活性均有不同程度的提高。

目前生產實踐中常使用高濃度、高毒性的化學農藥防治線蟲，不僅對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害，也不利于農業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展[10-11]。利用真菌代謝產物對線蟲進行生物防治越來越受重視[12]。來源于海洋的枝頂孢霉（Acremnium，BH0531）是已被證實的具有很好殺線蟲效果的海洋真菌，其代謝物具有分子質量小、易溶于水等特點[13]。在已用其代謝產物進行室內殺松材線蟲和根結線蟲試驗的基礎上，進一步將此代謝產物應用于溫室盆栽試驗，以探究其對盆栽黃瓜的生理狀況和保護酶活性的影響，為該菌應用到生產實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌種保藏號：CGMCC-5445，由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室提供。供試線蟲：根結線蟲（Meloidogyne incognita），采自感染根結線蟲病的大棚。供試黃瓜品種：‘新津春四號’，購自天津市黃瓜研究所。

1.2 發(fā)酵液的制備

1.2.1 菌種活化 將保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基，26℃下靜置培養(yǎng)6～7 d。

1.2.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng) 取新培養(yǎng)的菌株斜面，加入無菌水洗下孢子，制備成1×106個·mL-1的孢子懸浮液，以2%接種量接入裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中。26℃下120r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d。

1.2.3 發(fā)酵液的制備 將培養(yǎng)好的菌液1000r·min-1離心去菌體，再經孔徑為0.22 μm微孔濾膜真空抽濾，即為發(fā)酵濾液[14]。

1.3 根結線蟲2齡幼蟲（J2）的制備

采集大棚染病黃瓜根系，洗凈泥土，剪成1～2 cm的根段，加入1%（φ）的次氯酸鈉溶液，用粉碎機粉碎。分別過60、250、500目分樣篩，收集500目分樣篩節(jié)流物，即為根結線蟲的蟲卵粗提物。將40 mL蟲卵粗提物倒入100 mL離心管中，在離心管下層注入40 mL 40%的蔗糖溶液，使其分為2層，3 500 r·min-1離心5 min，水層和蔗糖溶液層中間的白色懸浮物就是蟲卵，用移液器吸出，用蒸餾水沖掉蔗糖溶液，得到純凈的蟲卵。將蟲卵放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待蟲卵孵化，采用貝爾曼漏斗法獲取二齡幼蟲，配制成1 000條·mL-1備用。

1.4 方法

1.4.1 試驗設計及黃瓜幼苗處理 黃瓜種子經55℃熱水浸泡10 min后，在30℃溫水中浸泡6 h，再用吸水紙和錫箔包好，置于30℃環(huán)境中催芽24 h。待其發(fā)芽后，點種到育苗穴中，于30℃光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待其長出第二片真葉后，移栽到花盆中，共計30盆，每盆1株，分為A組（試驗組）、B組（對照組），每組15株；所用土壤配比為V大田土∶V泥炭土∶V沙子=4∶4∶1，121 ℃濕熱滅菌 1 h。待黃瓜長出 3 片真葉時（20 d），A組接種根結線蟲，接種方法：根周圍打5個孔（12.5 mm×20 mm），注入線蟲懸浮液，接種量為每盆2 000條；B組15盆注入等量清水作為對照。同時，A、B組每盆分別加入 40 mL的BH0531菌株發(fā)酵濾液，以干物質含量計算，濃度梯度設置為：0（對照）、5、10、20、40 mg·mL-1，每個濃度設置3次重復。培養(yǎng)50 d后用于采樣測定。

1.4.2 黃瓜幼苗丙二醛含量的測定 接種根結線蟲30 d后，稱取剪碎的葉片1 g，加入2 mL 10%（ω）TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mLTCA進一步研磨，勻漿在4000r·min-1離心10min，上清液為樣品提取液。吸取離心的上清液2 mL（對照加2 mL蒸餾水），加入2 mL為0.6%（ω）TBA溶液，混勻物于沸水浴中反應15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定450、532、600 nm波長下的吸光值[15]。

1.4.3 黃瓜幼苗脯氨酸含量的測定 接種根結線蟲30 d后，稱取0.2 g黃瓜葉片，放入研缽，加入5 mL 3%（ω）磺基水楊酸溶液研磨成勻漿，把勻漿全部轉移到離心管中，沸水浴浸提10 min，冷卻后以 3 000 r·min-1離心 10 min，吸取上清液 2 mL，加 2 mL冰乙酸和3 mL顯色液，于沸水浴中加熱40 min，取出離心冷卻后各管加入5 mL甲苯，充分震蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層以空白對照在波長520 nm下比色，從標準曲線查出測定液中脯氨酸含量[15]。

1.4.4 黃瓜幼苗抗氧化保護酶活力的測定 接種根結線蟲30 d后，稱取0.5 g葉片放入研缽中，加2 mL 0.05 mol·L-1、pH=7.8 的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨，勻漿倒入10 mL離心管中，再加3 mL磷酸緩沖液沖洗研缽，4℃冷凍離心20 min（若做可溶性蛋白，轉速為4 000 r·min-1，若不做，則10 000 r·min-1），上清液（酶液）倒入試管中，置于 0～4℃下保存待用[16]。過氧化物酶（POD）的活性參照朱廣廉[17]的方法測定，多酚氧化酶（PPO）的活性參照李靖等[18]的方法測定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性參照薛應龍[19]的方法測定，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用 NBT法[20]，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定[21]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0選擇Duncan多重極差法進行差異顯著性分析，采用Origen 8.0軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響

發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響如表1所示。接種根結線蟲對黃瓜葉片丙二醛含量有增加效應，對照中A組比B組增加17.33%;丙二醛含量是植物細胞膜質過氧化程度的體現(xiàn)，膜質受害越嚴重丙二醛含量越高，而發(fā)酵濾液對丙二醛含量有抑制作用，尤其在受根結線蟲危害時，效果更為明顯，10、20 mg·mL-1發(fā)酵濾液降低丙二醛含量分別達到23.53%、22.99%。發(fā)酵濾液可有效緩解根結線蟲對黃瓜的毒害作用。

表1 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響 （μmol·g-1）

2.2 發(fā)酵濾液對黃瓜葉片脯氨酸含量的影響

經不同發(fā)酵液處理后，黃瓜葉片脯氨酸含量變化如表2所示。在根結線蟲脅迫條件下脯氨酸的含量顯著增加22.93%；發(fā)酵濾液對脯氨酸含量有明顯抑制作用，未接線蟲而加入不同濃度發(fā)酵液的黃瓜植株脯氨酸含量分別比對照降低了28.93%、31.58%、16.96%、49.14%，接線蟲組脯氨酸含量分別比對照降低了23.91%、10.93%、30.59%、、21.74%、40.15%，可能是發(fā)酵濾液的加入改善植物生長的環(huán)境，進而促進植物的生長。施用發(fā)酵液的黃瓜植株脯氨酸含量都顯著降低，A組、B組變化趨勢一致。

2.3 保護酶活力的變化

表2 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片脯氨酸含量的影響ω/（μg·g-1）

2.3.1 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片SOD比活力的影響 SOD是植物體內清除自由基的關鍵酶，可以清除植物體內因受害而產生的氧自由基，因此植物受害時酶活力升高，危害緩解時酶活力降低或沒有變化[22]。試驗結果顯示，染病黃瓜SOD的比活力（以蛋白質計）（50.34 IU·mg-1）比對照（41.74 IU·mg-1）增加20.61%，酶活力增強可清除自由基，進而減輕植物損傷。接線蟲組施用10 mg·mL-1發(fā)酵濾液對SOD比活力有顯著的增強作用，說明在特定濃度下發(fā)酵濾液能夠緩解根結線蟲對黃瓜植株的侵害。發(fā)酵濾液對接線蟲組SOD活性的影響趨勢表現(xiàn)為先增強后減弱，說明濃度是防治線蟲的關鍵因素，要選擇合適的濃度才能有效防治線蟲。未受線蟲感染組SOD活性隨施用濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，表示發(fā)酵濾液有利于提高黃瓜植株抗性，對植物有保護作用（圖1a）。

2.3.2 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片POD比活力的影響 黃瓜植株受到根結線蟲危害時POD比活力降低，POD活性降低能夠增加H2O2積累，H2O2能夠殺死侵入植物細胞的根結線蟲，增強植物對根結線蟲的抗性（圖1b）。未受線蟲侵染組，發(fā)酵濾液顯著降低了植株 POD 比活力（對照：427.52 IU·mg-1），分別降低38.79%、41.41%、48.26%、31.98%，說明發(fā)酵濾液對POD活性有抑制作用。

圖1 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片SOD（a）和POD（b）比活力的影響

2.3.3 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片CAT比活力的影響 CAT參與活性氧的代謝過程，可清除體內過氧化氫，使細胞免受H2O2的毒害。如圖2所示，根結線蟲對CAT比活力有抑制作用（比清水對照降低了49.28%），和POD一樣，CAT比活力的降低使得植物體內保持較高的活性氧水平，從而對線蟲產生毒害作用，殺死入侵線蟲。接線蟲組發(fā)酵濾液對CAT比活力有顯著的增加作用，分別比對照增加42.75%、19.05%、89.97%、73.01%，同樣是發(fā)酵濾液使CAT活性升到較高水平甚至是正常水平。未受線蟲感染組的CAT比活力在加入5、10、40 mg·mL-1發(fā)酵液時都顯示被抑制，在加入20 mg·mL-1發(fā)酵液時CAT比活力（18.36IU·mg-1）高于對照（16.93IU·mg-1）8.32%，發(fā)酵濾液對植株CAT活性作用比較復雜，合適的濃度才有利于加強植物的防御系統(tǒng)。

圖2 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片CAT比活力的影響

2.3.4 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片PAL比活力的影響 PAL是植物苯丙烷類代謝的關鍵酶，當細胞受侵時能促進抗菌物質和細胞結構屏障物質合成，減輕植物病害。如圖3a所示，根結線蟲對PAL比活力有降低的作用（降低了27.96%）；施用發(fā)酵濾液能夠顯著提高 PAL 比活力（對照：0.72 IU·mg-1），有利于增強黃瓜植株對根結線蟲的抗性，隨著發(fā)酵濾液濃度的增加，增強效應逐漸減弱（試驗組：0.92、0.92、0.88、0.84 IU·mg-1）；未受線蟲感染組施用發(fā)酵濾液對PAL比活力有顯著的降低效應（對照：0.99 IU·mg-1），且隨著濃度的增加效果越顯著（試驗組：0.88、0.83、0.79、0.89 IU·mg-1）。

圖3 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片PAL（a）及PPO（b）比活力的影響

2.3.5 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片PPO比活力的影響 PPO是酚類物質氧化的主要酶，其活性與植物抗病性密切相關，活性高說明抗性越高。未受根結線蟲感染組發(fā)酵濾液對黃瓜葉片PPO比活力有顯著的抑制作用，比對照（2.29 IU·mg-1）分別降低了18.95%、46.81%、55.44%、29.04%，作用效果隨著施用濃度的增加愈加明顯。黃瓜受根結線蟲侵害時，發(fā)酵濾液顯著增強了黃瓜葉片PPO比活力，比對照（0.88 IU·mg-1）分別增加 84.09%、65.09%、92.54%、68.19%，清水對照組植物受害相當嚴重，施用發(fā)酵濾液明顯緩解了根結線蟲對植物的侵害，提高了植株對根結線蟲的抗性（圖3b），這與SOD、POD、CAT和PAL表現(xiàn)趨勢類似。

3 討論

丙二醛（MDA）是膜質被氧化的產物，MDA含量可以作為細胞膜受害程度和植物抗病評價標準[23]。試驗結果顯示不同濃度發(fā)酵濾液均可降低MDA含量，對根結線蟲的危害起到緩解作用。脯氨酸是重要的滲透調節(jié)物質，在植物抗逆過程中可以維持原生質體與環(huán)境的滲透平衡[24]，可以作為植物抗逆性的生理指標。健康植株游離脯氨酸含量較低，植株受到脅迫后脯氨酸活力升高，以提高細胞滲透勢。發(fā)酵濾液能夠降低脯氨酸含量，可能是在一定程度內改善了植物生長的環(huán)境。

SOD、POD和CAT都與植物體內O2-的代謝有關，它們相互協(xié)調作用以維持植物體內O2-的正常水平，避免因過多氧自由基的存在而使植物受害。黃瓜受根結線蟲浸染，POD、CAT比活力均下降，植物體內的超氧陰離子不斷積累，對線蟲產生毒害作用，減輕線蟲對植物的損害。施用發(fā)酵濾液后，對根結線蟲產生毒害作用，減輕了線蟲對植株的侵染，致使POD比活力增強，可能是其在土壤中殺死根結線蟲，減輕其對黃瓜植株的侵染，降低了H2O2含量，起到保護植物的目的。SOD和CAT活性增強，且隨著施用發(fā)酵濾液濃度的增加，防御酶的比活力呈上升的趨勢，說明發(fā)酵濾液可提高植物的抗性，對植物起到了保護的作用。根結線蟲侵染黃瓜植株，PAL比活力下降，施用發(fā)酵濾液能夠提高PAL比活力，對根結線蟲表現(xiàn)出顯著的抑制作用。同樣，PPO活力與PAL活力表現(xiàn)出一致性，都是通過提高防御酶的活力來提高植株對根結線蟲的抗性。BH0531發(fā)酵濾液通過提高保護酶的活性來防治根結線蟲對植株的侵害，至于該菌是通過何種機制來影響保護酶活力進而實現(xiàn)殺線蟲作用的，還有待深入研究。