瓜菜類病原細菌耐藥外排泵RND研究進展

王 真，趙廷昌，楊玉文，關 巍 ，胡 俊

（1.內蒙古農業大學 呼和浩特 010019； 2.中國農業科學院植物保護研究所·植物病蟲害生物學國家重點實驗室 北京 100193）

瓜菜細菌性病害的防治手段單一，造成了大多數病原細菌對抗生素及銅制劑產生耐藥性。早在1962年美國佛羅里達州就發現了番茄瘡痂病菌的田間鏈霉素耐藥菌株[1]，之后有關植物病原細菌耐藥性的報道屢見不鮮。向平安等檢測了7株不同來源（中國）的辣椒瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria），發現4株辣椒瘡痂病菌具有較高的鏈霉素耐受性[2]。Shenge等調查了來自坦桑尼亞番茄產區的番茄細菌性斑點病病原菌（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria），發現所有菌株對銅制劑均有較高的耐受性[3]。

病原細菌對抗生素或銅制劑較強的適應性和耐受性，為瓜菜類致病細菌的防治帶來挑戰。病原細菌的耐藥機制多種多樣，而外排泵的發現，開啟了人類認識病原細菌的新篇章。依賴于能量的外排泵最早在哺乳動物中發現[4]。1983年George和Levy首次報道了細菌的外排泵可以增強其多耐抗生素的能力[5]。之后在Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa中發現的以耐藥結節分化家族（resistance-nodulation-division family，RND）為代表的多耐藥外排泵[6-10]成為人們關注的焦點。RND多耐藥外排泵對革蘭氏陰性細菌耐藥性貢獻很大，生物信息學分析表明RND外排泵廣泛存在于瓜菜作物病原細菌中。瓜菜作物RND外排泵不僅可以外排抗生素、抗菌素等有害物質，還可以被逆境激活，參與細菌侵染植物的整個過程[11-13]。但相關研究較少，具體機制還不明確。鑒于此，筆者綜述了病原細菌RND外排泵的結構與功能、細菌/植物互作過程中外排泵的作用及抑制劑等方面的研究進展，以期為瓜菜作物病原細菌耐藥性的研究提供參考。

1 RND外排泵家族的結構與功能

RND家族是一類三聚體外排泵，包含有內膜蛋白（IMP），位于周質的膜融合蛋白（MFP）和外膜蛋白（OMP）[14]。這3類蛋白貫穿于細菌的2層膜，協同完成細菌內有害物質的外排（圖1）。可根據其外排底物的不同將RND外排泵家族分為兩類，一類是疏水性或者兩親性的外排泵（HAE-RND）[15]；另一類是重金屬外排泵（HME-RND）。HAE-RND家族包括 AcrAB、MexAB-OprM、MexEF-OprN、MdtAB和MdtEF等系統，HME-RND家族目前報道的僅有CusCFBA系統[16]。這2類外排泵廣泛存在于瓜類和蔬菜病原細菌中，筆者以AcrAB和CusCFBA為代表介紹外排泵的結構與功能。

1.1 AcrAB-TolC外排系統的結構與功能

E.coli的Acr外排家族系統是RND外排泵研究的模型系統。Acr外排家族系統包括外膜通道TolC、膜內的次級轉運蛋白AcrB以及位于周質連接內外膜的通道蛋白AcrA。AcrB-AcrA-TolC外排泵可轉運多種結構不同的抗生素，賦予了細菌廣譜的抗生素耐藥性。

圖1 AcrABZ-TolC外排泵模型[16]

在E.coli中，位于周質的AcrA與細胞內膜通過氨基端脂質修飾連接在一起，其結構域包括周質膜區域、β桶狀區域、硫辛酰區域和α發夾區域[17]。其中α發夾區域與內膜的TolC蛋白結合，其他的區域可能與AcrB互作[18-21]。

AcrB貫穿于跨膜結構域和周質結構域[22]，包括3個非對稱的晶體結構，結構具有可旋轉性，可通過松散（L）、緊湊（T）、開放（O）型 3個結構的變化，實現底物的向外運輸功能[23-25]（圖1）。TolC外膜通道是由3個TolC單體組成的炮筒狀結構[26]，這個通道連接周質穿過細胞外膜一直通向細胞表面[27]。

1.2 CusCFBA外排系統

CusCFBA外排系統是瓜類和蔬菜作物病原細菌重要的銅外排系統，在植物病原細菌銅制劑耐受性方面具有重要的作用。CusCFBA外排系統（圖2）也是最具有代表性的一個HME-RND外排系統。它可以外排重金屬Ag+和Cu+，同時還可能參與磷霉素、二硝基苯酚、硝基苯與乙硫異煙胺的外排[28-29]，該外排泵有助于細胞內Cu+平衡的維持[30]。

圖2 CusBA復合結構[31]

CusCFBA外排系統由位于內膜的CusA，位于周質膜的CusB和位于外膜的CusC組成。這與AcrABC結構極為相似，其化學計量學分析結果表明 CusA∶CusB∶CusC 為 3∶6∶3[31-32]。

CusB系統包含4個亞結構域：3個β螺旋結構域和1個α螺旋結構域[33]。CusA包含12個跨膜α螺旋。CusB識別并結合Cu+和Ag+，之后將Cu+和Ag+傳遞給位于周質膜裂縫處CusA的M573、M623和M672等保守氨基酸殘基（圖3）。接收到重金屬離子的CusA構象會迅速改變，使得這些重金屬離子進入外排泵的周質區域中，或者直接通向細胞外[34]。另外，CusF與CusB相互作用，可能促進周質膜裂縫的打開；CusC自身的螺旋結構與CusB的α螺旋結構相互作用，構建了重金屬離子的外排通道[33]。

圖3 底物與CusA結合示意圖[34]

2 RND耐藥外排泵和病原細菌/作物互作的關系

如今植物基因組學和高通量測序等新技術已被廣泛應用于植物病原細菌毒力、病原細菌/植物互作以及病原細菌耐藥性分析，植物病原細菌Xanthomonas axonopodispv.citri，Xanthomonas campestrispv.campestris，Ralstonia solanacearum，Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，Erwinia carotovorasubsp.atroseptica和Xanthomonas oryzaepv.oryzae等的測序工作相繼完成[35-39]。測序結果顯示植物病原細菌基因組中含有大量的RND外排泵相關基因。RND外排泵不僅在細菌耐藥性方面具有重要作用，而且與細菌的致病性密切相關。另外，病原細菌的RND耐藥外排泵還參與細菌體代謝副產物的分泌，如RND外排泵轉運蛋白ToxGHI幫助Burkholderia glumaeBGR1外排毒黃素[40]。

Palumbo等最早發現Agrobacterium tumefaciens中的外排泵IfeAB運載體可以外排植物分泌的抑菌性物質異黃酮，并且在細菌定殖寄主作物過程中有著不可替代的作用[41]。在豆類作物病原細菌P.syringaepv.phaseolicola1448A、P.syringaepv.syringaeB728a和番茄病原細菌P.syringaepv.tomatoDC3000中，RND轉運蛋白復合體MexAB-OprM對化合物（如抗生素、植物源抗菌素、洗滌劑和染料等）有著非常高的耐受力。該蛋白復合體還參與細菌在植物體內的繁殖過程[42]。P.syringaepv.syringae染色體基因編碼的PseABC家族是其合成丁香毒素和丁香肽等毒素不可缺少的，pseC基因的缺失會減少植物毒素的合成和分泌量[43]。Vargas P等研究發現，番茄植株分泌的黃酮類物質可誘導丁香假單胞番茄致病變種P.syringaepv.tomato菌株PmeR蛋白的過表達，過表達的PmeR可抑制Mex-AB-OprM外排系統。PmeR和MexAB-OprM構成的互作系統，與菌株P.syringaepv.tomato在番茄植株上的定殖密切相關[44]。對丁香假單胞煙草致病變種P.syringaepv.tabaci鞭毛蛋白FliC的研究表明，ΔfliC較野生型菌株致病力和運動性都顯著降低，但是mexEFoprN（RND外排系統編碼基因）基因的表達量急劇上升。IV型菌毛（T4P）缺陷型突變體ΔpilA，其菌株富集能力及對煙草的致病力明顯減弱，參與其多耐藥外排泵MEX的相關基因mexABoprM的表達量明顯上升[45]。可見RND外排泵不僅在逆境適應、有害物質外排等方面有重要的作用，而且在P.syringae中與細菌的侵染力也密切相關。

E.chrysanthemi具有2個AcrAB外排系統，它們不僅可以幫助細菌抵抗菊苣分泌的抗菌肽硫素，而且輔助細菌定殖菊苣葉片，引起病害[46]。有研究認為E.chrysanthemi侵染植物，導致寄主植物水楊酸等抗菌物質分泌增多，而這些有毒的抗菌物質正好激活了細菌多耐藥外排泵編碼基因的表達，提高了細菌的侵染成活率[47]。該菌株中tolC編碼51kDa的蛋白與E.coli中TolC蛋白同源性高達70%。tolC基因缺失突變體不能外排鹽酸小檗堿；突變體在寄主植物內可以存活，但生長較慢，不足以造成病害[11]。Brown等通過對青枯菌（R.solanacearum）多耐藥外排泵相關基因acrA和dinF的功能研究發現缺失突變株對抗生素、植物毒素和洗滌劑的耐受性明顯低于野生菌株；對番茄植株侵染力相對較弱。這一結果也證實了RND外排泵在瓜菜病原細菌中具有雙重作用[48]。

梨火疫病菌（E.amylovora）主要侵染薔薇科作物。在侵染初期，病原細菌會暴露在植物體表面，并被植物分泌的大量抗菌素包圍。染料木黃酮是豆科作物或者非豆科作物分泌的異黃酮類抗菌素[49-50]，是植物抗毒素Phytoalexins和Phytoanticipins路徑合成抗菌素的前體[51-52]。Burse A等發現薔薇科分泌的異黃酮類抗菌素可誘導E.amylovora中外排泵編碼基因acrAB的大量表達。acrB缺失突變株致病力降低，對于果樹分泌的抗菌素變得敏感[53]。這與Al-Karablieh N等的研究結果不符。Al-Karablieh N等發現，E.amylovora基因tolC和acrB/tolC的缺失突變體對植物分泌的抗菌素及一些合成的抗菌劑較野生型敏感，而acrB缺失突變株對相關抗生素并不敏感。另外tolC和acrB/tolC缺失突變株的毒力并沒有降低，TolC可能通過與AcrAB的互作來保持植物體表面毒素的平衡，以輔助E.amylovora突破植物表層保護組織[54]。在AcrB外排泵缺失的突變株中，過表達轉運蛋白MdtABC和MdtUVW，可以使E.amylovora對黃酮類、梭鏈孢酸和新生霉素產生耐受性。MdtABC介導E.amylovora對膽鹽、硝酸鹽的抗性，其表達受雙組份調節系統BaeSR的調節；MdtUVW介導其對克霉唑的耐受性。MdtABC和MdtUVW的缺失也會阻礙細菌對寄主植物的侵染[55]。他們還證明了外排蛋白NorM在E.amylovora侵染植株花器官時，可以與花柱上寄生的分泌抗菌素類物質的泛菌屬競爭空間和營養，幫助E.amylovora完成侵染。而norM基因缺失突變株的毒力并沒有降低，自然條件下致病力卻下降[56]。

有關植物病原細菌銅制劑耐受性的研究較多，但是大都集中在對Cop系統的研究，有關Cus系統的研究相對較少[57-60]。Gutiérrez-Barranquero等通過對P.syringae全基因組信息的分析發現P.syringae的銅耐受性是由CopG、CusCBA和CopABCD操縱子協同作用完成的[61]。另外，劉星等驗證了Acidovorax citrulliRND外排泵相關基因cusB與Acidovorax citrulli菌株的銅耐受性密切相關。cusB缺失突變株較野生型對銅制劑更加敏感，但不影響致病力[62]。

3 外排泵抑制劑的開發

外排泵抑制劑（EPIs）是一類抑制細菌外排泵功能的藥物。利用它可使低濃度的抗生素起到較高的抗菌效果，同時減少細菌耐藥性的發生。它還可以抑制生物膜的形成，降低病原菌的毒力。EPIs的研究與應用對于瓜菜細菌性病害的防治意義重大，但是相關研究難度較大。在實驗室條件下，有效的EPIs已經有不少報道，但是目前還沒有可以應用于實踐的EPIs。

3.1 RND EPIs選取原則

實驗應用中EPIs必須具備以下幾個特點：第一，能促進細菌外排泵相關基因的表達；第二，藥劑本身對細胞無損害；第三，在其發揮作用的同時不影響質子的跨膜運輸；第四，不能增加非外排抗生素的活性；第五，不能影響抗生素的活性。這些限制因素使得實際篩選EPIs時困難重重。例如，對細菌能量平衡影響較大的羰基氰氯苯腙（CCCP）可作為一種抑制細菌外排泵的化合物。然而，該類化合物嚴重消耗了細菌膜質子動力，從而導致了細菌的死亡[63]。再如，外排泵調控基因有很多，而且調控功能多且復雜，很難通過對一種或者一類調控基因的抑制作用深入解析其抑制外排泵的分子機制，同時，在理論研究上，對于大部分調控基因的作用機制尚不明確，加大了研究難度。

3.2 研究較多的EPIs

目前研究較多的2類EPIs包括肽類EPIs和吡啶并嘧啶類EPIs，它們也是最具代表性的2類EPIs。

3.2.1 肽類EPIs PAβN（苯丙氨酸-精氨酸-氨酸萘酰胺，起初稱為MC-207，110），英文全稱phenylalanyl arginyl β-naphthylamide，是研究最早最有價值的一種EPI[64]，其結構如圖4。Renau等通過對Pseudomonas aeruginosa中 MexAB、MexCD 和 Mex-EF基因過表達，從200 000個可增強P.aeruginosa菌株敏感性的小分子EPIs中篩選得到了該化合物[65]。PAβN作為外排泵的結合底物，與抗生素競爭結合區域[66]，提高細胞內抗生素濃度，從而達到抑制抗生素外排的作用。作為一種廣譜性的EPIs，它還可以使結構不同的抗生素如氟喹諾酮類、大環內酯類、惡唑烷酮類、氯霉素和利福平等抗生素恢復生物活性，但不能恢復β內酰胺以及氨基糖苷類抗生素活性[64]。這類化合物最突出的優點在于，它很難使細菌對其產生耐藥性。但是該類化合物的親和力較差，必須當底物濃度積累到一定程度才能發揮作用[67]。此類化合物會阻礙細胞膜的功能，對細胞具有一定的毒性[68]，這限制了其應用前景。然而PAβN衍生物如MC-04，124，在細胞液中的穩定性高，且毒性很小，同時不會使外排泵的調控基因表達過高[69]。

圖4 兩類抗生素的分子式[64]

3.2.2 吡啶并嘧啶類 EPIs-ABI-PP（D13-9001）D13-9001（圖4）是與RND外排泵作用過程研究最清楚的一類EPIs。其作用機制是D13-9001與AcrB、MexB的疏水端結合，影響AcrB/MexB的空間結構的改變，破壞底物與AcrB/MexB末端的運輸通道造成外排泵功能故障，藥物在細菌體內積累，進而達到抑制外排的效果[70]。D13-9001的親水端存在于細菌外排泵的通道，可能阻礙底物與外排泵在這一區域的結合。

與肽類 EPIs-PAβN相比，吡啶并嘧啶類EPIs-ABI-PP安全低毒或無毒、水溶性好、藥效突出[71]，具有較大的應用前景。它可以特異性地抑制AcrAB-TolC和MexAB-OprM外排泵，但是對MexXY-OprM外排泵沒有抑制效果[72]，這也是它沒能應用于實踐中的主要原因。

4 展望

外排泵廣泛存在于瓜類和蔬菜作物病原細菌中，在細菌抵抗外界脅迫過程中發揮著重要作用。目前有關RND外排泵結構與功能、外排抑制劑等的研究已取得很大的進展。植物病原細菌P.syringae，A.tumefaciens，Rhizobium etli和Bradyrhizobium japonicum中相關多耐藥RND外排泵的研究已見報道，但相關機制并不清楚[73-75]。

RND多耐藥外排泵是細胞代謝的外排結構，在細胞代謝中具有重要作用。在正常的細菌體內，RND外排泵相關基因的表達應該有特定的生理調節方式，對這一調控體系的研究有助于我們了解細菌適應環境的機制。另外，有關植物分泌物對病原細菌的吸引導致病害發生的研究甚多[76]。然而，病原細菌RND多耐藥外排泵對植物分泌物的響應機制的研究，可以說還是一個未開發的領域。已經有研究證明，細菌RND外排泵直接參與細菌有毒物質的外排[77]，植物分泌的抗菌素類外排底物或許可以作為生物源藥劑，通過化學合成其類似物并用于對細菌的防治。針對RND多耐藥外排泵在病原細菌/植物互作中的重要作用的研究，也將給我們對細菌致病機制、入侵手段、植物防御特點等的研究提供思路。

綜上所述，系統研究植物病原細菌RND多耐藥外排泵對病原細菌的科學防治具有重大意義。相信隨著分子生物學、生物信息學等相關領域的發展，對于外排泵的研究會更加的深入，這也將會給瓜菜細菌性病害的防治提供新的更好的措施。