赤芍總苷對自發性高血壓大鼠血小板sCD4OL和炎癥因子的干預作用

肖文豪，王卓，李瑞瑩，李國標，林忠偉（.廣東藥科大學 附屬第一醫院風濕科，廣東 廣州 50080；.中山大學 附屬第一醫院病理科，廣東廣州50080；.廣東藥科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州50080；.廣東藥科大學附屬第一醫院心內科，廣東廣州50080）

赤芍總苷對自發性高血壓大鼠血小板sCD4OL和炎癥因子的干預作用

肖文豪1，王卓2，李瑞瑩3，李國標4，林忠偉4
（1.廣東藥科大學 附屬第一醫院風濕科，廣東 廣州 510080；2.中山大學 附屬第一醫院病理科，廣東廣州510080；3.廣東藥科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州510080；4.廣東藥科大學附屬第一醫院心內科，廣東廣州510080）

目的探討赤芍總苷（TPG）對自發性高血壓大鼠（SHR）血小板功能及血清sCD4OL水平和炎癥因子的干預作用。方法8周齡雄性SHR40只隨機分為赤芍高、低劑量組、阿司匹林組、生理鹽水對照組，另設Wistar大鼠作為正常對照組，連續灌胃給藥8周。實驗結束后，取全血檢測白細胞計數、血小板計數、平均血小板容積（MPV）、血漿凝血酶原時間、血脂水平；取血清，散射比濁法檢測hs-CRP，ELISA法測定可溶性CD40L（sCD40L）和一氧化氮（NO）水平。結果血清膽固醇及三酰甘油水平、白細胞總數、血漿凝血酶原時間、血小板計數在5組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SHR大鼠MPV、sCD40L及hs-CRP水平升高，血清NO水平明顯下降，與正常對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；TPG高劑量組MPV、sCD40L、hs-CRP水平降低，NO水平升高，與生理鹽水對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。相關性分析顯示，SHR組MPV與血清hs-CRP、sCD40L水平呈正相關（r=0.36，P＜0.05；r=0.48，P＜0.01）；hs-CRP與 sCD40L水平呈正相關（r=0.31，P＜0.05）。結論 赤芍總苷能降低 SHR大鼠sCD40L、hs-CRP水平，提高NO水平，可作為高血壓治療的輔助方法。

赤芍總苷；自發性高血壓大鼠；血小板；可溶性CD40L；炎癥因子

赤芍總苷（total paeony glycoside，TPG）為赤芍的總提取物，主要為單萜苷類化合物，包括芍藥苷（3.1%～7.0%）、芍藥內酯苷（0.1%）、羥基芍藥苷（0.06%）、苯甲酰芍藥苷（0.01%）等組成［1］。TPG具有抗血栓、抗凝血的作用［2］，徐紅梅等［3］采用比濁法觀察TPG對大鼠血小板聚集功能的作用，證明TPG能降低ADP誘導的血小板最大聚集強度，但TPG在抗血小板，特別是對高血壓病中血小板功能的研究尚未見報道。近年來的研究表明，血小板CD40L水平可作為反映血小板活化的指標之一［4］。本研究應用不同濃度的赤芍總苷對自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）進行灌胃處理，研究TPG對高血壓血小板功能及可溶性CD40L （soluble CD40L，sCD40L）的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

40只8周齡雄性SHR大鼠作為實驗組和8只8周齡雄性Wistar大鼠作為對照組，SPF級，體質量120～140 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號:SCXK（京）2012-0003。

1.2藥品與試劑

TPG由廣東藥科大學中醫學院管淑玉教授利用乙醇回流法提取工藝提取獲得，TPG純度達95%以上；阿司匹林片由廣東藥科大學附屬第一醫院藥房提供；TPG灌胃劑量參考既往文獻所描述劑量［5］。NO ELISA試劑盒（批號:A5757）和sCD40L ELISA試劑盒（批號:M03800）均購自上海研吉生物有限公司。

1.3主要儀器

ZH-HX-Z型無創尾動脈血壓測量系統（安徽正華生物設備有限公司）；全血細胞自動分析儀（中國邁瑞公司）；自動凝血分析儀（法國STAGO公司）。

1.4分組與給藥

將40只SHR大鼠隨機分為低劑量赤芍組、高劑量赤芍組、阿司匹林組和生理鹽水對照組，每組10只。赤芍低、高劑量組分別以100、200 mg/（kg·d）TPG以生理鹽水溶解至2 mL灌胃給藥；阿司匹林組以阿司匹林20 mg/（kg·d）生理鹽水溶解至2 mL后灌胃；每天測大鼠體質量，按大鼠體質量計算所用藥物劑量調整給藥，連續8周；生理鹽水對照組用生理鹽水2 mL灌胃。正常對照組自然喂養，不做任何處理。

1.5檢查指標

大鼠飼養8周后，經尾動脈測血壓，稱體質量，應用4%（φ）水合氯醛麻醉后，開腹取下腔靜脈血，干燥管取2 mL血離心，提取血清后，采用散射比濁法檢測高敏C反應蛋白（hs-CRP），以ELISA法測定sCD40L和一氧化氮（nitric oxide，NO）水平；同時以EDTA管取血2 mL，全血細胞自動分析儀檢測白細胞計數、血小板計數和平均血小板體積（MPV）；肝素抗凝管取血2 mL，應用自動凝血分析儀檢測血漿凝血酶原時間（PT）。

1.6統計學處理

采用SPSS17.0 for windows軟件，計量資料用表示，兩樣本均數比較采用t檢驗；單因素多組間比較，方差齊時，采用單因素方差分析（one-way analysis of varience，ANOVA），組間多重比較應用LSD檢測；方差不齊時，采用welch檢驗統計量，組間多重比較應用 Dunnett T3檢測。兩變量相關性分析采用pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組一般資料比較

大鼠飼養至16周齡，各組的體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。16周齡SHR與同周齡Wistar大鼠比較，血壓明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。血清膽固醇及三酰甘油水平、PT、白細胞總數在5組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2各組血小板參數及血清NO、sCD40L、hs-CRP水平的比較

血小板計數在5組間差異無統計學意義（P＞0.05）；生理鹽水對照組MPV、sCD40L及hs-CRP水平均高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），赤芍總苷高劑量組MPV、sCD40L及hs-CRP水平下降，與生理鹽水對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；生理鹽水對照組血清NO水平明顯下降，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；赤芍總苷高劑量組NO水平升高，與生理鹽水對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3SHR大鼠MPV與血清hs-CRP、sCD40L水平的相關性

SHR組MPV與血清hs-CRP水平呈正相關（r= 0.36，P＜0.05）；MPV與血清sCD40L水平呈正相關（r=0.48，P＜0.01）；hs-CRP與sCD40L水平呈正相關（r=0.31，P＜0.05）。見圖1。

3　討論

表1　各組一般資料的比較Table 1 General data in five groups（s）

表1　各組一般資料的比較Table 1 General data in five groups（s）

與正常對照組比較:*P＜0.05。

組別　n　　體質量/ g血壓/ mmHg c（膽固醇）/ （mmol·L-1）c（三酰甘油）/ （mmol·L-1）PT/ s白細胞/ （109·L-1）赤芍低劑量組　10　275.65±16.20　222±18.30*　1.77±0.58　0.78±0.06　16.80±2.34　5.46±0.98赤芍高劑量組　10　269.56±15.34　216±15.40*　1.75±0.63　0.75±0.05　17.10±3.21　6.02±2.10阿司匹林組　10　270.45±12.35　230±16.80*　1.79±0.78　0.81±0.09　16.50±4.32　5.78±1.12生理鹽水對照組　10　268.34±10.87　224±14.50*　1.82±0.43　0.83±0.08　16.30±5.62　5.62±1.24正常對照組　8　272.48±11.67　146±24.60　1.81±0.56　0.85±0.07　16.50±4.21　5.54±1.98

表2　血清NO、sCD40L和hs-CRP水平的變化Table 2 Levels of serum NO，sCD40L and hs-CRP in five groups（±s）

表2　血清NO、sCD40L和hs-CRP水平的變化Table 2 Levels of serum NO，sCD40L and hs-CRP in five groups（±s）

與正常對照組比較:*P＜0.05；與生理鹽水對照組比較:#P＜0.05。

組別　n　　血小板/ （109·L-1）MPV/ （fL）ρ（NO）/ （IU·mL-1）ρ（sCD40L）/ （ng·mL-1）ρ（hs-CRP）/ （ng·mL-1）赤芍低劑量組　10　822.64±84.68　7.21±0.15*　35.54±2.80　205.63±15.21#　0.199±0.05*赤芍高劑量組　10　816.56±112.54　6.82±0.85*#　38.23±4.76#　201.52±11.83#　0.196±0.03*#阿司匹林組　10　854.24±65.34　7.24±0.56*　34.49±4.01　218.32±10.54*　0.203±0.04*生理鹽水對照組　10　847.20±78.92　7.34±0.16*　32.43±3.21*　225.41±12.18*　0.214±0.03*正常對照組　8　822.72±94.32　6.30±0.25　35.56±5.23　200.54±13.82　0.101±0.06

圖1　MPV與血清hs-CRP、sCD40L水平的相關性Figure 1 Correlations between MPV and the levels of hs-CRP and sCD40L

CD40L（CD154）為一種Ⅱ型跨膜的三聚體蛋白質，含261個氨基酸殘基，相對分子質量為39 000，屬于TNF超家族，其編碼基因位于X染色體q26.3～q27.1的位置［4］。sCD40L是溶解型CD40L，約95% sCD40L來源于活化的血小板，是血小板受到活化后，通過蛋白酶水解發生脫顆粒，形成sCD40L并釋放到血流中［6］。Patel等［7］研究發現，血清中 CD40L的濃度越高，高血壓發病因素越多。有研究表明，應用阿司匹林抗血小板治療可以降低 sCD40L水平［8］，在目前高血壓疾病的治療中，阿司匹林治療作為高血壓疾病導致心腦血管并發癥的一級預防。高血壓患者存在血小板活化和炎癥反應標記物CRP水平明顯升高，MPV增加［9］和hs-CRP水平升高，兩者水平呈正相關［10］，本研究發現，16周齡SHR大鼠MPV及血清sCD40L均高于同周齡Wistar大鼠，存在不同程度的血小板活化現象，可能為高血壓導致管壁張力增高和血流壓力梯度造成血小板活化有關［11］。經TPG治療后，高劑量TPG可以降低MPV和sCD40L水平，與生理鹽水對照組比較，差異有統計學意義，說明TPG可以抑制sCD40L水平，起到抑制血小板活化作用。但本研究尚未能看到TPG 對SHR大鼠PT有所影響，可能與既往研究方法不同有關。

高血壓患者的血漿sCD40L升高，激活血小板，通過減慢新生血管生成速度，造成血管損傷［12-13］。而在非勺型高血壓患者中，上述效應更加明顯，并且升高的sCD40L與尿白蛋白、hs-CRP、頸動脈內膜中層厚度（CIMT）呈正相關，與血流介導的血管舒張功能（FMD）呈負相關［14］。本研究發現，16周齡SHR大鼠hs-CRP明顯升高，NO水平明顯下降，經TPG治療后，hs-CRP水平下降，NO水平升高，可能與TPG可以降低大鼠血漿中TXB2的濃度，抑制炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α和ICAM-1的作用，起到減輕氧化應激［15］，同時升高血漿中6-keto-PGF1A的水平，調節大鼠血清 NO/ET的平衡有關［5］。同時，MPV與血清hs-CRP、sCD40L水平呈正相關，表明血小板活化和炎癥反應參與了高血壓的發生發展，赤芍總苷能抑制三者的水平，可以作為高血壓病的輔助治療手段。

綜上所述，TPG作為赤芍的總提取物，能夠抑制血小板活化，抑制炎癥因子的水平，提高血清NO水平，起到中醫“活血化瘀”的功效，但其臨床應用的安全性及有效性有待進一步研究。

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（責任編輯：幸建華）

Effect of total paeony glycoside on platelet function and soluble CD40L and inflammatory factors expression in spontaneously hypertension rats

XIAO Wenhao1，WANG Zhuo2，LI Ruiying3，LI Guobiao4，LIN Zhongwei4
（1.Department of Rheumatology，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China；3.Department of Laboratory，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；4.Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China）

Objective To investigate the effect of total paeony glycoside（TPG）on platelet function and the level of soluble CD40L and inflammatory factors in spontaneously hypertension rats（SHR）.Methods 40 male SHRs，at 8-week-old，were randomly divided into four groups，including the low and high doses of TPG groups，the aspirin group and the saline group.Wistar rats（n=8）were also designed as the control group. After intragastric administration 8 weeks，the count of white blood cell（WBC）and platelet，mean platelet volume（MPV），clotting time and lipid levels were measured.The level of serum high sensitivity C-reactive protein（hs-CRP），sCD40L and nitric oxide（NO）were also examined by scatter turbidimetry and ELISA，respectively.Results There was no significant difference on the levels of serum cholesterol and triglyceride，the counts of WBC and platelet and clotting time in these five groups.Compared with the control group，MPV and the levels of sCD40L and hs-CRP，but not NO，were increased in the saline group.Compared with the saline group，treatment with the high dose of TPG obviously decreased MPV and the levels of sCD40L and hs-CRP，but incrased NO level in SHRs.The correlation between MPV and the levels of hs-CRP and sCD40L was significant（r=0.36，P＜0.05；r=0.48，P＜0.01）.The correlation between the level of hs-CRP and sCD40L was significant（r=0.31，P＜0.05）.Conclusion TPG can reduces the levels of serum hs-CRP and sCD40L，which may be used for the adjuvant therapy in hypertension.

totalpaeonyglycoside；spontaneouslyhypertensionrat；platelet；solubleCD40L；inflammation factor

醫院藥學

R544.1；R285

A

1006-8783（2016）04-0481-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016042301

2016-04-23

廣東省中醫藥局科研課題立項項目（20142086）

肖文豪（1967—），男，本科，主治醫師，主要從事風濕病研究，Email:xiaowenhao99@163.com；通信作者:林忠偉（1979—），男，博士，副主任醫師，主要從事高血壓、冠心病研究，Email:gdpcxn3110@163.com。

網絡出版時間:2016-07-08 14:59 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1459.004.html