東北地區煙草靶斑病菌(Rhizoctoniasolani)融合群、致病力分化及品種抗病性研究

蘇燕妮,　董　雪,　趙艷琴,　孫宏偉,　孫劍萍,　吳元華*

(1. 沈陽農業大學植物保護學院,沈陽　110866; 2.內蒙古民族大學農學院,通遼　028000; 3.黑龍江省煙草研究所,牡丹江　157011)

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東北地區煙草靶斑病菌(Rhizoctoniasolani)融合群、致病力分化及品種抗病性研究

蘇燕妮1,董雪1,趙艷琴2,孫宏偉3,孫劍萍3,吳元華1*

(1. 沈陽農業大學植物保護學院,沈陽110866; 2.內蒙古民族大學農學院,通遼028000; 3.黑龍江省煙草研究所,牡丹江157011)

2013-2014年吉林省、黑龍江省煙區首次大面積發生煙草靶斑病,損失嚴重。采集吉林省柳河縣、黑龍江省林口縣和賓縣的煙草靶斑病病葉進行分離純化,得到了12個菌株。將所獲菌株分別與立枯絲核菌標準融合群菌株AG-2、AG-3、AG-4進行對峙培養,結果表明:此12個菌株均與立枯絲核菌AG-3標準菌株發生融合反應,不與其他融合群發生融合;隨機選取3個縣各1個代表性菌株,提取菌絲基因組DNA并對其ITS序列進行分析與比對,菌株HLJ-2、JL-1、HLJ-7的ITS序列與遼寧省煙草靶斑病菌菌株LF-2、LJT-8(AG-3融合群)的同源性達99%～100%, 因此推斷,吉林省、黑龍江省煙草靶斑病菌與遼寧省煙草靶斑病菌應屬于同一個融合群,即立枯絲核菌AG-3融合群(RhizoctoniasolaniAG-3)。根據各菌株在鑒別寄主上表現的抗性不同,可將吉林省、黑龍江省所有菌株分為3個致病類型,即致病類型Ⅰ、致病類型Ⅱ和致病類型Ⅲ。同一省份不同菌株間致病力有差異,黑龍江省菌株3種致病類型均有,以致病類型Ⅱ為主;吉林省菌株只有致病類型Ⅰ和致病類型Ⅱ。分別選取3個省的強致病力菌株,用離體葉片接種法鑒定了我國21個主栽煙草品種對靶斑病的室內抗病性,結果表明:沒有免疫或抗病品種,‘龍江981’、‘NC297’對供試的3個強致病力菌株均表現中抗,‘中煙202’、‘云煙97’、‘NC55’、‘KRK26’和‘G28’分別對不同菌株表現中抗。

煙草靶斑病菌;東北地區;融合群;致病力;抗病性

(1. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang110866, China;2. College of Agriculture, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao028000, China;3. Tobacco Institute of Heilongjiang Province, Mudanjiang157011, China)

由RhizoctoniasolaniKühn引起的煙草靶斑病是在遼寧省發現的我國近年新報道的真菌病害[1],該病害病原的有性世代為瓜亡革菌[Thanatephoruscucumeris(Frank) Donk]。其危害葉片,形成較大病斑,對煙葉的產量和品質造成顯著影響。2013-2014年吉林省和黑龍江省一些煙葉產區靶斑病大面積流行,煙葉損失十分嚴重。目前關于靶斑病菌的生物學特性、融合群、致病力分化以及侵染機制等已有報道[2-4],但對于我國其他地區陸續發現的該病害卻未曾開展比較研究。鑒于吉林與黑龍江省首次發現煙草靶斑病,為進一步弄清東北三省煙草靶斑病菌的親緣關系及遺傳多樣性,為今后病害流行預警以及綜合防治提供理論支撐,本文將吉林省、黑龍江省煙葉產區靶斑病菌菌株的融合群、ITS序列與遼寧省的菌株進行了比對分析,并對東北三省病原菌的致病力分化以及我國部分主栽煙草品種對靶斑病的室內抗病性進行了鑒定,報道如下。

1　材料與方法

1.1煙草靶斑病發病情況調查

2013-2014年于吉林省柳河縣、黑龍江省林口縣和賓縣等煙葉產區,調查并采集病害標本,分離鑒定病原菌。

1.2病原菌的分離

從新鮮煙草病葉的病健交界處取樣,采用常規組織法分離,于培養箱中25℃恒溫培養24～48 h。待菌絲長出,根據Parmeter等[5]的鑒定標準,鏡檢確認是立枯絲核菌后,切取單支菌絲尖端,進行單菌絲的分離純化,轉移到PDA斜面上培養,以獲得菌株的純培養,于4℃冰箱保存備用。

1.3菌株融合群測定

參照陳延熙[6]的玻片對峙培養法,將鑒定出的菌株分別與AG-3、AG-2、AG-4標準菌株進行融合觀察。

1.4rDNA-ITS 序列擴增及分析

隨機選取3個地區的菌株JL-1、HLJ-7、HLJ-2,將菌株分別轉移到放有玻璃紙的PDA平板上,25℃恒溫培養3 d后,用滅過菌的藥匙刮取菌絲,液氮下充分研磨,提取菌絲DNA。DNA提取所用試劑盒購于北京天根生物公司,提取過程嚴格按照說明書操作。

采用真菌核糖體基因內轉錄間隔區(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對煙草靶斑病菌JL-1、HLJ-7和HLJ-2的rDNA-ITS序列進行PCR擴增。

PCR擴增反應體系:反應總體積為50 μL,10×PCR Buffer 5.0 μL,MgCl2(25 mmol/L)4.0 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4.0 μL,ITS1(10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2.0 μL,模板DNA(50 ng/μL)1.0 μL,Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,ddH2O 31.5 μL。PCR擴增程序為94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個循環;72℃延伸1 min。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,并在凝膠成像系統觀察拍照。將PCR產物送至上海生工生物公司進行純化并測序,測序結果在GenBank核酸序列數據庫進行同源序列搜索,并做序列比對、分析。

1.5煙草靶斑病菌致病力測定

參照趙艷琴等[4]的方法,對吉林省、黑龍江省的煙草靶斑病菌致病力分化進行研究,選取對煙草靶斑病具有抗病性差異的煙草品種‘VRG2’、‘K326’、‘G80’為鑒別寄主。煙苗9葉期采摘中、下部葉片,每個處理10片葉,每個菌株3次重復,無菌PDA圓片接種作為對照,接種5 d后測量病斑直徑,計算病情指數,確定鑒別寄主的抗感性,對各靶斑病菌株致病力進行對比。

1.6煙草品種對靶斑病室內抗病性鑒定

供試21個品種為全國煙草主栽品種,試驗在沈陽農業大學溫室中進行。煙苗9葉期采摘中、下部葉片,每個處理10片葉,每個品種3次重復。以3個省強致病力代表菌株LN-9、JL-3、HLJ-7分別接種,無菌PDA圓片接種作為對照,所有菌絲圓片均用無菌棉花球保濕,48 h后揭去棉花,接種5 d后測量病斑直徑,并計算病情指數,參照趙艷琴等[4]煙草靶斑病抗感劃分標準,確定供試煙草品種的抗感性。

2　結果與分析

2.1煙草靶斑病的發生與分布

2013-2014年吉林省柳河縣、黑龍江省林口縣和賓縣等煙葉產區大面積發生煙草靶斑病。吉林省煙草靶斑病發生區域主要以東南部的柳河縣為主,黑龍江省煙草靶斑病發病區域主要以東部的林口縣和中部的賓縣為主,其他產煙縣也均發生靶斑病,危害較重。

2.2立枯絲核菌的分離與鑒定

從吉林省柳河縣、黑龍江省林口縣和賓縣采集的煙草靶斑病病葉上分離得到12株立枯絲核菌菌株,其中菌株JL1～4來自于吉林省柳河縣;菌株HLJ1～4來自于黑龍江省林口縣;菌株HLJ5～8來自于黑龍江省賓縣。其形態特征符合Parmeter等[5]對立枯絲核菌的描述:無性世代不產生任何孢子;菌絲分支在其起源處有縊縮,且距起源處不遠有隔膜,隔膜具桶孔;直角或銳角分支,菌體呈深淺不同的褐色;細胞多核;多形成內外結構均一的菌核等。

2.3立枯絲核菌菌絲融合群測定

用玻片對峙培養法,進行菌絲融合觀察。結果表明:采集到的12個煙草靶斑病菌菌株全部與AG-3融合群標準菌株發生菌絲完全融合或不完全融合;而不與AG-2融合群、AG-4融合群標準菌株發生融合(圖1)。

圖1　菌絲間的完全融合(左)與完全不融合(右)Fig.1　The complete fusion (left) and non-fusion (right) of two hyphae

2.4rDNA-ITS序列擴增及分析

用微量紫外分光光度計對提取的靶斑病菌基因組DNA進行檢測,其A260/A280與A260/A230比值均在1.8～2.0之間;瓊脂糖電泳檢測結果表明:條帶整齊、清晰,無彌散拖尾的現象,表明提取的DNA樣品完整性好且純度高,可用于后續的PCR擴增。將DNA用TE緩沖液稀釋至濃度為50 ng/μL,置于-20℃冰箱中備用。

采用通用引物ITS1和ITS4對煙草靶斑病菌菌株JL-1、HLJ-7、HLJ-2基因組DNA的ITS區和5.8S區進行擴增,將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條特異性條帶(圖2),片段大小為660 bp左右,與目的片段大小基本一致。測序結果表明:菌株JL-1、HLJ-7的ITS序列長度均為666 bp,菌株HLJ-2的ITS序列長度為668 bp。將所獲得的3個菌株的序列進行BLAST比對可知:菌株HLJ-2與遼寧省的LF-2菌株(登錄號為JQ219154)的ITS序列同源性高達100%;菌株JL-1和 HLJ-7與遼寧省的LJT-8菌株(登錄號為JQ219155)的ITS序列同源性為99%,LF-2和LJT-8均為立枯絲核菌AG-3融合群,因此進一步證實吉林省、黑龍江省菌株均為立枯絲核菌AG-3融合群。

圖2　不同來源菌株rDNA-ITS序列PCR產物電泳圖Fig.2　Electrophoresis pattern of rDNA-ITS products from different strains

2.5煙草靶斑病菌致病力測定

采用離體葉片接種法測定了分離自吉林省、黑龍江省的煙草靶斑病菌的致病力,根據各菌株在鑒別寄主‘VRG2’、‘K326’、‘G80’上的抗性差異,可將測試菌株劃分為3個致病類型(表1)。菌株HLJ-7、JL-3屬于致病類型Ⅰ即強致病類型;有8個菌株屬于致病類型Ⅱ即中等致病類型,包括HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3、HLJ-4、JL-1、JL-2、HLJ-8、JL-4;菌株HLJ-6、HLJ-5屬于致病類型Ⅲ即弱致病類型。

2.6煙草品種對靶斑病室內抗病性鑒定

以3個省的強致病力菌株分別接種不同煙草品種,抗病性鑒定結果表明:目前所收集的21個我國煙草主栽品種中沒有對靶斑病免疫的品種;對遼寧省菌株LN-9表現為中抗的品種有4個,包括‘KRK26’、‘G28’、‘NC297’和‘龍江981’,感病品種有17個,包括‘云煙97’、‘云煙87’、‘紅花大金元’、‘NC89’、‘中煙201’、‘中煙202’、‘NC102’、‘中煙203’、‘中煙104’、‘Coker86’、‘中煙103’、‘NC55’、‘中煙101’、‘K326’、‘云煙85’、‘Coker176’、‘龍江911’。對吉林省代表菌株JL-3表現為中抗的品種也有4個,即

‘中煙202’、‘NC55’、‘NC297’和‘龍江981’,其余品種均表現為感病或高感。對黑龍江省代表菌株HLJ-7表現為中抗的品種亦有4個,分別為‘龍江981’、‘云煙97’、‘NC55’、‘NC297’,其余品種均表現為感病或高感(表2),綜合看來,‘NC297’和‘龍江981’對3個省的強致病力菌株均表現中抗。

表1　煙草靶斑病菌致病類型的劃分Table 1　Division of pathogenic type of the strains

表2　不同煙草品種對不同靶斑病菌株的抗病性1)Table 2　Disease-resistance of tobacco varieties to different Rhizoctonia solani strains

1) HR為高抗,病情指數為1～10;R為抗病,病情指數為11～34;MR為中抗,病情指數為35～55;S為感病,病情指數為56～77;HS為高感,病情指數78及以上[4]。

HR: High resistance (Disease index: 1-10);R: Resistance (Disease index: 11-34);MR: Moderate resistance (Disease index: 35-55);S: Susceptible (Disease index: 56-77);HS: High susceptible (Disease index: 78-100)[4]

3　結論與討論

利用立枯絲核菌的培養特性、形態特征和致病性等進行種間或種內鑒定存在一定的困難。Parmeter等[5]提出的絲核菌種內的融合分類法已被廣泛采用。根據菌絲間的融合類型,可將菌絲間發生不完全融合和完全融合的菌株劃分到一個融合群(anastomosis group,簡稱AG);菌絲間發生完全不融合的菌絲分屬于不同的融合群。此外,真菌的rDNA-ITS序列也可作為真菌分類的依據[7]。Nicoletti等[8]報道意大利的煙草靶斑病主要由立枯絲核菌AG-3融合群菌株引起,同時也分離得到了AG-2和AG-4融合群菌株,但遼寧省煙草靶斑病菌僅屬于AG-3融合群,未分離鑒定到其他融合群菌株[9]。本文從吉林省、黑龍江省的煙草靶斑病病葉上分離獲得的12個菌株,經玻片對峙培養法測定均屬于AG-3融合群;進一步應用分子生物學技術對所采集分離的煙草靶斑病菌rDNA的內轉錄間隔區(ITS)序列進行分析,并與GenBank中的序列進行同源性比對,吉林省和黑龍江省的各菌株與遼寧省菌株同源性達到99%～100%。綜上融合群試驗和ITS序列分析,認為吉林省與黑龍江省的煙草靶斑病菌菌株也均為AG-3融合群。

在自然情況下,立枯絲核菌常存在致病力分化的現象。本文采用離體葉片接種法對來自于吉林省和黑龍江省的12個菌株的致病力進行了測定,表明不同菌株間致病力有差異。結合趙艷琴等[4]對遼寧省煙草靶斑病菌菌株致病力的研究結果認為:東北地區不同省份煙草靶斑病菌菌株致病力分化程度是不同的,遼寧省和黑龍江省菌株均有3種致病類型,其分布與地區來源沒有相關性,均以中等致病力為主;吉林省菌株僅有強致病類型和中等致病類型,也以中等致病力菌株為主。因此利用抗病品種時,應考慮病原菌的致病性發生變異潛力的大小,很多抗病品種在病原菌出現新的生理小種或者高毒力菌株后成為感病品種,因此,病原菌的致病力分化在抗病育種及推廣品種的工作中應引起相關工作者的重視。

本文采用離體葉片接種法對不同煙草品種的抗病性進行了評價,并未發現對煙草靶斑病菌有免疫的品種,但研究表明,‘龍江981’、‘NC297’這兩個品種對供試的3個強致病力菌株均表現中抗,同時有幾個品種如‘中煙202’、‘云煙97’、‘NC55’、‘KRK26’和‘G28’分別對不同菌株表現中抗。本文研究結果對于煙葉產區品種選用和合理栽培布局提供了重要的理論支撐。

[1]吳元華,王左斌,劉志恒,等. 我國煙草新病害—煙草靶斑病[J].中國煙草學報,2006,12(6):22-23.

[2]伏穎, 趙秀香, 趙艷琴, 等. 煙草靶斑病(Thanatephoruscucumeris)侵染特性研究[J]. 中國煙草學報, 2012,18(5): 56-60.

[3]吳元華,趙艷琴,趙秀香,等.煙草靶斑病原鑒定及生物學特性研究[J].沈陽農業大學學報,2012,43(5):521-527.

[4]趙艷琴, 吳元華, 伏穎, 等. 煙草靶斑病菌(Rhizoctoniasolani)致病力分化研究[J]. 沈陽農業大學學報, 2013, 44(4): 472-474.

[5]Parmeter J R, Sherwood R T, Paltt W D.Anastomosis grouping among isolates ofThanatephoruscucumeris[J]. Phytopathology, 1969,59:1270-1278.

[6]陳延熙, 張敦華, 段霞瑜, 等. 關于Rhizoctoniasolani菌絲融合分類和有性世代的研究[J]. 植物病理學報, 1985, 15(3): 139-143.

[7]Kuninaga S,Carling D E, Takeuchi T，et al. Comparison of rDNA-ITS sequences between potato and tobacco strains inRhizoctoniasolaniAG-3 [J]. Journal of General Plant Pathology,2000, 66:2-11

[8]Nicoletti R, Lahoz E, Contillo R，et al. Anastomosis groups and pathogenicity ofRhizoctoniasolaniisolates from tobacco in Italy [J].Diagnosis and Identification of Plant Pathogens,1997,11:325-327.

[9]吳元華,伏穎,趙秀香,等. 煙草靶斑病病菌菌絲融合群及ITS序列分析[J]. 植物病理學報,2013,43(2):215-218.

(責任編輯：王音)

Anastomosis groups, pathogenicity differentiation of

Rhizoctoniasolanifrom tobacco target spot in the Northeast China and the disease resistance of tobacco varieties

Su Yanni1,Dong Xue1,Zhao Yanqin2,Sun Hongwei3,Sun Jianping3,Wu Yuanhua1

Tobacco target spot disease occurred widely for the first time in Jilin and Heilongjiang provinces in 2013 and 2014. Twelve isolates ofRhizoctoniasolaniwere isolated from the diseased samples from tobacco growing regions in Jilin and Heilongjiang provinces. Confront culture test showed that all the 12 isolates belonged toR.solaniAG-3. The rDNA-ITS sequence of the HLJ-2, JL-1 and HLJ-7 strains were amplified and sequenced. The ITS sequence homology of HLJ-2,JL-1 and HLJ-7 comparing with LF-2 and LJT-8 were up to 99%-100%. The results also showed that all the strains from Jilin and Heilongjiang provinces wereR.solaniAG-3. According to the different resistance on the indicator tobacco varieties, the 12 isolates were divided into three pathogenic types, pathotypeⅠ, pathotype Ⅱand pathotype Ⅲ, respectively. It suggested that the isolates of tobacco target spot from different provinces had clearly pathogenicity differentiation. Identification of the disease resistance of 21 tobacco varieties inoculated with three strong pathogenic strains from different provinces revealed that there was no immune or resistant varieties, ‘Longjiang981’, ‘NC297’ were moderate resistant to the three strong pathogenic isolates, and ‘Zhongyan202’, ‘Yunyan97’, ‘NC55’, ‘KRK26’ and ‘G28’ were all moderate resistant to different pathogenic isolates.

Rhizoctoniasolani;the Northeast China;anastomosis group;pathogenicity;disease resistance

2014-12-19

2015-03-10

國家煙草專賣局科技項目[國煙辦綜(2010)182號];遼寧省煙草專賣局科技攻關項目[遼煙計(2010)86號]；中國煙草總公司科技重點項目[中煙辦(2010)221號]

E-mail:suyn1989@126.com

S 435.72

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.031