液相色譜法測定芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻中的貯存穩定性

谷　巖,　梁　爽,　侯志廣,　趙曉峰,　王鑫宏,　逯忠斌

(吉林農業大學資源與環境學院,長春　130118)

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液相色譜法測定芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻中的貯存穩定性

谷巖,梁爽,侯志廣,趙曉峰,王鑫宏,逯忠斌*

(吉林農業大學資源與環境學院,長春130118)

建立了芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中殘留的高效液相色譜分析方法,并研究了二者在水稻樣品中的貯存穩定性。貯存在-18℃和-20℃下水稻樣品經提取凈化后,采用高效液相色譜儀-紫外檢測器,在240 nm波長下對試樣中的芐嘧磺隆和仲丁靈進行分離和定量分析。結果表明,芐嘧磺隆和仲丁靈的峰響應面積與進樣濃度呈現良好的線性關系,其相關系數分別為0.999 7和0.999 9。芐嘧磺隆的相對標準偏差為0.5%～12.0%,回收率為77.2%～104.6%。仲丁靈的相對標準偏差為0.8%～7.6%,回收率為73.0%～106.4%。芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻5種基質中貯存90 d后分解率小于5%,符合FAO/WHO聯合標準的等同認定要求。芐嘧磺隆和仲丁靈具有良好的穩定性。

芐嘧磺隆;仲丁靈;水稻;高效液相色譜法;貯存穩定性

芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl,BSM)屬磺酰脲類除草劑,主要用于水稻田防除一年生和部分多年生闊葉雜草和莎草科雜草[1-3]。仲丁靈(butralin)屬于二硝基苯胺類芽前除草劑[4-5],對一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草具有良好的防效[6]。二者復配可擴大殺草范圍,增強防治效果。對于二者的殘留分析方法，已報道的主要有高效液相色譜法[7-9]和氣相色譜法[10-11]等。而采用高效液相色譜同時分析芐嘧磺隆和仲丁靈的方法目前尚未見報道。在水稻樣品貯存過程中,目標農藥穩定與否直接關系到試驗數據的可靠性[12],因此,明確不同農藥在基質中的最佳貯存條件和貯存時間非常重要,從而保證被分析農藥在貯存時期內未發生變化。EPA[13]、OECD[14]和FAO[15]的準則中對農藥殘留的貯存穩定性試驗做了要求與規定,殘留試驗樣品應該在采樣或收獲24 h內冷凍貯存。研究表明，農藥在低溫冷凍條件下貯存通常會更穩定[16-19]。故本文選擇常用低溫冷凍溫度-18℃和-20℃,研究了芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中的貯存穩定性,并建立了兩者的高效液相色譜分析方法。

1　試驗材料與方法

1.1主要儀器和試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配紫外檢測器);Thermo-BDS Hypersil C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);水浴恒溫振蕩器;超聲波清洗器;植物粉碎機;高速攪拌器;旋轉蒸發儀;減壓抽濾器;層析柱等玻璃器皿。

芐嘧磺隆標準品(質量分數為97.5%),仲丁靈標準品(質量分數為99.5%),由德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司提供;32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑(有效成分含量:2%芐嘧磺隆,30%仲丁靈),由江蘇省蘇州市寶帶農藥提供。其他試劑包括：乙腈(色譜純);水(二次蒸餾水);冰乙酸,甲醇,二氯甲烷,乙酸乙酯(均為分析純);中性氧化鋁和弗羅里硅土。

1.2色譜條件

流動相為乙腈-0.1%冰乙酸。

土壤、稻田水、稻殼、植株提取樣品梯度洗脫條件：0～6 min，保持55%乙腈；7～20 min，保持80%乙腈；21 ～33 min，保持55%乙腈。保留時間：芐嘧磺隆為6.3～6.5 min；仲丁靈為16.8～17.0 min。

糙米提取樣品梯度洗脫條件：0～13 min，保持58%乙腈；13～21.5 min，保持79%乙腈；22～35 min，保持58%乙腈。保留時間：芐嘧磺隆為5.6～5.8 min；仲丁靈為17.6～17.8 min。

土壤、稻田水、稻殼、植株提取樣品梯度洗脫條件:0～6 min,保持55%乙腈；7～20 min,保持80%乙腈；21～33 min,保持55%乙腈。保留時間:芐嘧磺隆為6.3～6.5 min；仲丁靈為16.8～17.0 min。

糙米提取樣品梯度洗脫條件:0～13 min,保持58%乙腈；13～21.5 min,保持79%乙腈；22～35 min,保持58%乙腈。保留時間:芐嘧磺隆為5.6～5.8 min；仲丁靈為17.6～17.8 min。

1.3標準曲線的繪制

分別稱取芐嘧磺隆標準品0.0102 g、仲丁靈標準品0.010 0 g(均精確至0.000 2 g),分別置于10 mL容量瓶中,甲醇定容配制成標準母液,分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L共5個不同質量濃度的標準溶液,搖勻,按照1.2給出的色譜條件進行測定,以進樣濃度x為橫坐標,以對應的色譜峰響應面積值y為縱坐標,進行線性回歸,得到標準曲線。

1.4樣品前處理

1.4.1樣品的提取

稻田土壤、糙米、稻殼:稱取土壤50.0 g,糙米20.0 g,稻殼10.0 g,于具塞三角瓶中,加入80 mL乙腈和10 mL水,恒溫水浴振蕩1 h,在輔有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾,收集濾液,置于裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中上下振蕩150次,靜置1 min,再上下振蕩100次,靜置1 h,取40 mL上清液濃縮后待凈化。

水稻植株:稱取植株20.0 g,加入80 mL乙腈,組織搗碎后,在輔有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾,收集濾液,置于裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中上下振蕩150次,靜置1 min,再上下振蕩100次,靜置1 h,取40 mL上清液濃縮后待凈化。

稻田水:量取50 mL稻田水,置于250 mL分液漏斗中,加入1 mol/L鹽酸溶液,pH調至2～3,乙酸乙酯(40、40、40 mL)萃取3次,過裝有適量無水硫酸鈉的漏斗后,用平底燒瓶收集濾液,用旋轉蒸發器在40℃下減壓濃縮至近干,氮氣吹干后,5 mL甲醇定容,過0.22 μm濾膜,待液相色譜測定。

1.4.2柱層析凈化

裝柱：用于凈化土壤、糙米、稻殼提取物的層析柱從下至上依次為2 cm無水硫酸鈉、2 g弗羅里硅土和2 cm無水硫酸鈉;用于凈化植株提取物的層析柱從下至上依次為2 cm無水硫酸鈉、3 g中性氧化鋁和2 cm無水硫酸鈉。

凈化：將土壤、植株、稻米和稻殼提取后濃縮的樣品轉移至層析柱中,先用20 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)預淋洗,再用100 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)洗脫,洗脫液置于旋轉蒸發器中在40℃下減壓濃縮至近干,隨后用氮氣吹干。凈化后的土壤樣品用5 mL甲醇定容;植株、糙米、稻殼樣品用2 mL甲醇定容,用0.22 μm濾膜除菌,待液相色譜測定。

1.5方法的準確度和精密度

用未施用過芐嘧磺隆和仲丁靈的稻田水、土壤、植株、稻殼和糙米樣品(空白對照)分別進行3個添加水平(0.05、0.5、1.0 mg/L)的添加回收試驗,每個水平重復5次。按照上述樣品前處理方法和色譜條件測定方法回收率。

1.6貯存穩定性試驗

32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑的田間試驗施藥濃度通常為低劑量(推薦劑量)和高劑量(1.5倍推薦劑量,有效成分504 g/hm2),本試驗在室內模擬田間試驗,濃度設置為有效成分2 520 g/hm2(高劑量的5倍)。

分別稱取稻田土壤空白樣品5.0 kg、稻田水空白樣品3.0 L、植株空白樣品 2.0 kg、糙米空白樣品2.0 kg、稻殼空白樣品1.0 kg置于不同容器內,再分別稱取0.052 5、0.030 5、0.020 6、0.020 6和0.010 3 g 32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑,兌水溶解后均勻噴施于土壤、稻田水、植株、糙米和稻殼樣品中,混勻,置于-18℃和-20℃冰箱內保存(使用溫度記錄儀觀察溫度變化)。每個樣品的每個溫度處理設3次重復。在施藥后 0.5 h、7、15、30、60、90 d采集樣品,檢測樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈的濃度變化。

2　結果與分析

2.1色譜條件的選擇

為了能使芐嘧磺隆和仲丁靈與雜質有效分離,先后試驗了甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%冰乙酸的流動相對兩種除草劑的峰形、分離度、出峰時間,最終選擇乙腈-0.1%冰乙酸,并根據樣品基質不同設置梯度洗脫,使芐嘧磺隆和仲丁靈有較好的分離效果,峰形對稱,保留時間適中,可以滿足分析要求。

2.2檢測波長的確定

芐嘧磺隆的最大吸收在238 nm處,仲丁靈的最大吸收在240 nm處,綜合樣品中2個有效成分的含量,確定240 nm為最佳檢測波長。

2.3方法的線性關系

結果表明,芐嘧磺隆和仲丁靈峰響應面積值y與進樣濃度x有著良好的線性關系,線性回歸方程為：芐嘧磺隆y=26.873x+0.797 7,相關系數為0.999 7;仲丁靈y=113.42x+1.018 8,相關系數為0.999 9。(圖1)

圖1　芐嘧磺隆和仲丁靈的標準曲線Fig.1　Standard curve of bensulfuron-methyl and butralin

2.4方法精密度和準確度

在選定的色譜條件下,以3倍信噪比計算得芐嘧磺隆和仲丁靈的方法最小檢出量(LOD)為0.310 ng和0.057 ng,最低檢測濃度均為0.100 mg/L。不同方法添加回收試驗結果見圖2和表1。由表可知:在3個不同質量分數添加水平下,平均回收率為73.0%～106.4%;相對標準偏差為0.5%～12.0%,分析結果符合農藥殘留量分析與檢測技術的要求。

圖2　水稻土壤中的芐嘧磺隆和仲丁靈的色譜圖(芐嘧磺隆:6.3～6.5 min,仲丁靈:16.8～17.0 min)Fig.2　Chromatograms of two pesticides in paddy soil (bensulfuron-methyl:6.3～6.5 min,butralin:16.8～17.0 min)

2.5貯存穩定性

芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻土壤、稻田水、植株、糙米和稻殼中的殘留量與施藥后的取樣時間之間的穩定性見圖3,由圖3可知,水稻殘留樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈的殘留量隨貯存時間無明顯變化,-18℃與-20℃差異不顯著,經數據分析得出兩者在此條件下貯存,分解率均小于5%,符合FAO/WHO聯合標準的等同認定要求。由此證明,兩者在低溫冷凍貯存過程中穩定性良好。

表1　芐嘧磺隆和仲丁靈在不同水稻樣品中的添加回收率(n=5)Table 1　Recoveries of bensulfuron-methyl and butralin in different matrix(n=5)

圖3　芐嘧磺隆和仲丁靈的貯存穩定性Fig.3　Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin

3　結論與討論

本文建立了高效液相色譜同時測定水稻樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈兩種藥物殘留的分析方法。根據相似相溶原理,采用甲醇、二氯甲烷、乙腈、丙酮和乙酸乙酯的溶液作為水稻樣品的提取液,結果發現,二氯甲烷提取土壤樣品時,會出現土壤凝結現象,提取效果不好。丙酮提取植株后葉綠素等雜質峰較多。甲醇和乙酸乙酯做提取溶劑時添加回收率較乙腈低,故最終選擇乙腈作為提取溶劑。分別采用上述溶劑的混合溶液作為水稻樣品的淋洗液,當選用二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)時,提取效果好,回收率較高,較穩定。由于植株中色素等雜質較多,而中性氧化鋁對于色素的吸附優于弗羅里硅土,且該方法回收率達到農藥殘留檢測要求,故選擇中性氧化鋁柱層析凈化植株樣品。

其次,比較了-18℃和-20℃下芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中的貯存穩定性,樣品貯存90 d后農藥穩定性好,分解率均小于5%,兩個溫度差異不顯著,符合FAO/WHO聯合標準的等同認定要求。

綜上所述,本方法前處理簡便快速、凈化效果好,芐嘧磺隆和仲丁靈在相應的濃度范圍內線性良好、檢測靈敏可靠,水稻樣品中的芐嘧磺隆和仲丁靈在低溫(-18℃和-20℃)冷凍條件下貯存穩定性良好。

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(責任編輯：楊明麗)

Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin in rice samples using HPLC

Gu Yan,Liang Shuang,Hou Zhiguang,Zhao Xiaofeng,Wang Xinhong,Lu Zhongbin

(College of Resource and Environment, Jilin Agricultural University, Changchun130118, China)

A method has been developed for determining bensulfuron-methyl and butralin residues in rice samples by high performance chromatography (HPLC), and the storage stability of different test samples under different conditions (-18℃ and -20℃) were also investigated. The results showed that the peak area of bensulfuron-methyl and butralin are positively correlated to their concentration with correlation coefficients of 0.999 7 and 0.999 9, respectively. The relative standard deviations for bensulfuron-methyl detection were 0.5%-12.0%, and the average recovery rates were 77.2%—104.6%. The relative standard deviations for butralin detection were 0.8%—7.6%, and the average recovery rates were 73.0%—106.4%. Both bensulfuron-methyl and butralin had good storage stability and their degradation rates were both less than 5% in rice matrix during 90 days storage period.

bensulfuron-methyl;butralin;rice;HPLC;storage stability

2014-11-27

2015-02-03

農業部農藥殘留試驗項目(2014NCJ09)

E-mail:luzong1979@aliyun.com

S 451.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.028