番茄細(xì)菌性葉斑病菌RPA檢測(cè)技術(shù)

魏梅生,　田　茜,　趙文軍,　李桂芬,　孔　君

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京　100029)

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番茄細(xì)菌性葉斑病菌RPA檢測(cè)技術(shù)

魏梅生,田茜,趙文軍*,李桂芬,孔君

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京100029)

番茄細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonas syringaepv. tomato,Pst)是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物,可隨種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)對(duì)于防止該病害的擴(kuò)散傳播具有重要意義。依據(jù)番茄細(xì)菌性葉斑病菌的hrpZPst基因序列,設(shè)計(jì)并篩選出特異性擴(kuò)增引物,建立了番茄細(xì)菌性葉斑病菌的重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增(RPA)檢測(cè)方法。該方法可從10種不同的植物病原細(xì)菌中特異性地檢測(cè)到3個(gè)參試番茄細(xì)菌性葉斑病菌株。對(duì)病菌DNA的檢測(cè)靈敏度為75fg/μL,與PCR凝膠電泳相當(dāng)。該方法擴(kuò)增核酸時(shí)間短、效率高、對(duì)設(shè)備的要求低,適合于基層簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。本文為該病原菌的檢測(cè)提供了新方法。

番茄細(xì)菌性葉斑病菌;重組酶聚合酶擴(kuò)增;RPA;等溫?cái)U(kuò)增;檢測(cè)

番茄細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato, Pst)是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物,主要危害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實(shí)。病菌在種子、病殘?bào)w、土壤和雜草上越冬,可隨種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。自1933 年在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái),該病在美國(guó)、英國(guó)、俄羅斯、加拿大、法國(guó)、南非、澳大利亞等26個(gè)國(guó)家和中國(guó)的吉林、遼寧、黑龍江、河北、天津、甘肅、新疆、福建、廣西、臺(tái)灣等地有發(fā)生報(bào)道[1-7],且有逐年上升的趨勢(shì),對(duì)我國(guó)的番茄生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。

經(jīng)典的細(xì)菌鑒定方法，如利用菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化反應(yīng)等對(duì)植物細(xì)菌病害進(jìn)行診斷，經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng),而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR和免疫PCR 等技術(shù)已廣泛用于植物病原細(xì)菌的檢測(cè)[8],但該類技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備和人員要求比較高,適合于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè),對(duì)于設(shè)備不足的基層實(shí)驗(yàn)室,難以應(yīng)用。20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)了等溫核酸體外擴(kuò)增(isothermal amplification)技術(shù)的報(bào)道[9]。等溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)是在恒定溫度下,通過(guò)一些特殊的蛋白(酶)使DNA 雙鏈解螺旋,并促使特異性DNA 片段擴(kuò)增,以達(dá)到核酸體外擴(kuò)增的效果。因等溫核酸體外擴(kuò)增不需要高溫變性、退火和延伸的環(huán)節(jié),核酸擴(kuò)增變得更加便捷,也擺脫了對(duì)核酸擴(kuò)增儀的依賴。

等溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)有多種形式,包括鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification, SDA) 、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcription-mediated amplification, TMA)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(loop-mediated amplification, LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling-circle amplification, RCA)和依賴解旋酶擴(kuò)增(helicase-dependent amplification, HDA)等[10-11]。目前最接近常溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)是重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA),RPA技術(shù)是一種在常溫下可以使核酸快速擴(kuò)增的方法。在25～42℃范圍內(nèi)的等溫條件下,重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合, 形成酶和引物的聚合體,當(dāng)引物在模板DNA 上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí),在單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA binding protein, SSB)的作用下,使模板DNA 解鏈,并在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互補(bǔ)鏈。與普通PCR的產(chǎn)物一樣,RPA擴(kuò)增出來(lái)的是單一的產(chǎn)物[12]。

英國(guó)TwistDx公司較早開(kāi)展RPA擴(kuò)增技術(shù)研究,美國(guó)植物病害診斷試劑公司Agdia公司采用TwistDx的RPA技術(shù),建立了AmplifyRPTMDNA 擴(kuò)增平臺(tái),用于柑橘黃龍病(CandidatusLiberibacter asiaticus)的檢測(cè)。但目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到RPA技術(shù)在植物細(xì)菌病害檢測(cè)和應(yīng)用研究方面的相關(guān)報(bào)道。本研究建立了番茄細(xì)菌性葉斑病菌RPA檢測(cè)方法,以期為基層簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)室提供一種方便適用的快速檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株來(lái)自于美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)、英國(guó)國(guó)家植物病原細(xì)菌保藏中心(National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,NCPPB)和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所。

這些細(xì)菌分別是番茄細(xì)菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)菌株ATCC BAA-871、 NCPPB 1106、 LX-11(本所收藏);十字花科黑斑病菌(Pseudomonassyringaepv.maculicola)菌株ATCC 51322;獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)菌株NCPPB 3738;黃瓜細(xì)菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)菌株NCPPB 540;核果樹(shù)潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum)菌株ATCC 13395;桃樹(shù)潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.persicae)菌株NCPPB 2254;番茄細(xì)菌性髓部壞死病菌(Pseudomonascorrugata)菌株ATCC 29736;菜豆暈疫病菌(Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola)菌株LMG 5473(本所收藏);辣椒斑點(diǎn)病菌(Xanthomonasaxonopodispv.vesicatoria)菌株NCPPB 701;番茄潰瘍病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)菌株ATCC 7429。

1.2主要試劑和設(shè)備

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);TwistAmp Basic 試劑盒(TwistDx);ExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA marker (TaKaRa);dNTPs (Promega); Veriti 96孔梯度PCR儀 (AB Applied Biosystems); ND-1000 分光光度計(jì)(NanoDrop); H2O3-PRO金屬浴[金銀杏生物科技(北京)有限公司]。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)及DNA制備

將細(xì)菌菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(酵母膏1 g,牛肉浸膏3 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,瓊脂15 g,雙蒸水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH 至7.2,高壓滅菌121℃,15 min)平板上畫線,于28℃ 培養(yǎng)2～3 d,獲得純培養(yǎng)物,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)說(shuō)明書(shū),分別提取供試細(xì)菌的DNA,用作RPA和PCR反應(yīng)的模板。

1.4引物設(shè)計(jì)

參照番茄細(xì)菌性葉斑病菌hrpZPst基因序列(GenBank: AY999001.1)和文獻(xiàn)[13]-[15],結(jié)合RPA引物設(shè)計(jì)的特點(diǎn),采用NCBI的Primer-BLAST在線軟件共設(shè)計(jì)8條引物(表1)。

表1　測(cè)試用引物Table 1　Primers used in this assay

1.5RPA反應(yīng)

取2 μL番茄細(xì)菌性葉斑病菌DNA作為模板,DEPC處理過(guò)的超純水11.2 μL、10 μmol/L的正向引物2.4 μL、10 μmol/L的反向引物2.4 μL、干粉溶解緩沖液(rehydration buffer) 29.5 μL,加280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL啟動(dòng)反應(yīng),總體積為50 μL,混勻后38℃ 孵育40 min。同時(shí)以滅菌超純水代替細(xì)菌DNA作為空白對(duì)照,并用TwistAmp Basic試劑盒中提供的引物和模板DNA作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)是否正常。擴(kuò)增產(chǎn)物用回收試劑盒純化。

1.6常規(guī)PCR

取2 μL的細(xì)菌模板DNA,加10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL、DEPC處理過(guò)的超純水17.2 μL、10 μmol/L的正向引物1 μL、10 μmol/L的反向引物1 μL、10 mmol/L 的dNTPs 1 μL、5 U/μL 的ExTaqDNA聚合酶0.3 μL,總體積為25 μL,混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、57℃復(fù)性45 s、72℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,反應(yīng)結(jié)束后保存于4℃。

1.7電泳

取5 μL RPA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖上電泳30 min,凝膠成像儀上拍照 。

2　結(jié)果與分析

2.1引物的篩選

用所設(shè)計(jì)的8條引物建立9種檢測(cè)組合(表2),以番茄細(xì)菌性葉斑病菌的DNA為模板進(jìn)行RPA反應(yīng),篩選擴(kuò)增效率高的引物對(duì)。結(jié)果顯示,所有組合均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段,試劑盒陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出預(yù)期的143 bp 片段,空白對(duì)照未擴(kuò)增出產(chǎn)物。從凝膠電泳圖片分析,T1、T2和T3組合產(chǎn)物擴(kuò)增量較大,條帶清晰,其中T1組合條帶最粗亮,擴(kuò)增效率最高;T6、T7、T8、T9擴(kuò)增較明顯,T4、T5擴(kuò)增較弱(圖1)。因此,選擇T1引物對(duì)用于后續(xù)RPA方法檢測(cè)靈敏度和特異性測(cè)試。

表2　RPA擴(kuò)增用的引物對(duì)Table 2　Primer pairs for RPA

圖1　9對(duì)RPA引物組擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Amplification results of nine RPA primer pairs

2.2RPA 檢測(cè)靈敏度

將番茄細(xì)菌性葉斑病菌菌株ATCC BAA-871的DNA做10倍梯度稀釋,用引物對(duì)p1-f/p1-r分別進(jìn)行RPA和PCR凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果表明,檢測(cè)靈敏度均為75 fg/μL DNA。靈敏度相當(dāng)(圖2)。

圖2　RPA 法和PCR法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2　Sensitivity test results of RPA and PCR methods

2.3RPA方法的特異性測(cè)試

利用5株番茄病原細(xì)菌和7株近緣細(xì)菌菌株進(jìn)行該RPA方法特異性測(cè)試。結(jié)果表明,3個(gè)供試的番茄細(xì)菌性葉斑病菌菌株均能擴(kuò)增出282 bp的目標(biāo)片段,而其他9種病原細(xì)菌未擴(kuò)增出282 bp的目標(biāo)片段(圖3),表明利用RPA能特異性擴(kuò)增出番茄細(xì)菌性葉斑病菌的目標(biāo)片段,可用于快速檢測(cè)。

圖3　RPA法檢測(cè)番茄細(xì)菌性葉斑病菌的特異性Fig.3　Specificity test results of RPA for Pst

3　討論

本文建立的番茄細(xì)菌性葉斑病菌RPA檢測(cè)方法,38℃等溫條件下就能實(shí)現(xiàn)DNA 解鏈并在40 min內(nèi)完成目標(biāo)DNA 的快速擴(kuò)增,可特異性檢測(cè)到3個(gè)供試的番茄細(xì)菌性葉斑病菌菌株,對(duì)其他9種細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果為陰性,RPA檢測(cè)番茄細(xì)菌性葉斑病菌(ATCC BAA-871)的靈敏度和普通PCR的結(jié)果相當(dāng),均可達(dá)到75 fg/μL DNA。

RPA對(duì)引物的要求比較嚴(yán)格。用于RPA擴(kuò)增的引物通常由30～35個(gè)核苷酸組成,這種較長(zhǎng)的引物與模板序列嚴(yán)格互補(bǔ),使RPA擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物特異性高,普通PCR引物(長(zhǎng)度通常為20 個(gè)左右的核苷酸)不能用于RPA擴(kuò)增,而RPA的引物卻可用于PCR擴(kuò)增。

RPA對(duì)儀器設(shè)備的要求比PCR要低,不需要貴重的PCR儀,一臺(tái)小型的金屬浴或水浴鍋即可完成反應(yīng),若配以瓊脂糖凝膠電泳或小型便攜設(shè)備[16],1 h內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果,適合基層簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

RapiddetectionofPseudomonas syringaepv. tomatobyRPAmethod

WeiMeisheng,TianQian,ZhaoWenjun,LiGuifen,KongJun

(Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing100029, China)

BacterialspeckoftomatocausedbyPseudomonas syringaepv. tomato (Pst)isaseriousdiseaseintomatoandathreattotomatoproduction,whichcouldbetransmittedbyinfectedseeds.PstisconsideredaquarantineorganismandsubjecttophytosanitaryregulationsinChina.Rapidandconvenientdetectionmethodisimportantforthediseasecontrol.Arecombinasepolymeraseamplification(RPA)assaywasdevelopedbasedonthehrpZPstgenesequence.ThreeisolatesofPstcanbespecificallydetectedandotherninebacterialstrainsgotnegativeresult.ThedetectionlimitofRPAforbacterialgenomeDNAisabout75fg/μL,similartoPCRagarosegelelectrophoresis.Themethodisrapid,sensitive,andsuitableforuseinprimarylevellaboratory.

Pseudomonassyringaepv.tomato;recombinase polymerase amplification;RPA;isothermal amplification;detection

2014-12-14

2015-01-03

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310071)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAK11B02)

E-mail:wenjunzhao@188.com

S436.412

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.027