枯草芽胞桿菌HZB02的分離及其室內(nèi)抑菌效果

周小林,　黃振文,　劉人豪,　葛　磊,　顧衛(wèi)兵

(1.南通科技職業(yè)學(xué)院,南通市植物有害生物監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南通　226007;2. 中興大學(xué)植物病害管理實(shí)驗(yàn)室,臺(tái)中　40227; 3. 南通舜德生物制品有限公司, 南通　226000)

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枯草芽胞桿菌HZB02的分離及其室內(nèi)抑菌效果

周小林1*,黃振文2,劉人豪3,葛磊1,顧衛(wèi)兵1

(1.南通科技職業(yè)學(xué)院,南通市植物有害生物監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南通226007;2. 中興大學(xué)植物病害管理實(shí)驗(yàn)室,臺(tái)中40227; 3. 南通舜德生物制品有限公司, 南通226000)

從施用SupperGreen的小白菜‘鳳山5號(hào)’根際土壤中分離篩選到1株對(duì)白菜炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌菌株HZB02。該菌株對(duì)白菜炭疽病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、盆栽白菜發(fā)病等均有明顯的抑制能力。根據(jù)菌落形態(tài)、菌體電鏡觀察及16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果判斷,該菌株屬于Bacillus subtilissubsp. subtilis。進(jìn)一步研究不同培養(yǎng)基條件及添加大豆油對(duì)HZB02抗生作用的影響,發(fā)現(xiàn)其在SYMA、PDA培養(yǎng)基上抑制炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的能力最佳,此外其SYM、PDB發(fā)酵液對(duì)炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用亦最強(qiáng),然而它的TSB發(fā)酵液則顯示出最優(yōu)抑制菌絲生長(zhǎng)的效果。研究發(fā)現(xiàn)在SYM與PDB中添加5%大豆油的發(fā)酵液可顯著提升HZB02的抑菌功效。

枯草芽胞桿菌;拮抗細(xì)菌;白菜炭疽病菌;室內(nèi)抑菌

近幾年來(lái),因?yàn)槭称放c環(huán)境生態(tài)的安全問(wèn)題,農(nóng)藥及化肥的使用受到越來(lái)越多的限制,不用任何化肥農(nóng)藥的有機(jī)栽培法得到了較多的推行。這給作物病害的治理帶來(lái)了兩個(gè)方面的變化,一是田間的病害種類發(fā)生了巨大的改變,比如有機(jī)田易發(fā)生由Colletotrichum higginsianum引起的白菜炭疽病、Sclerotium rolfsii(無(wú)性世代)導(dǎo)致的白絹病等病害[1];二是非農(nóng)藥植保手段要設(shè)法彌補(bǔ)農(nóng)藥限制所留下的空間,其中生物防治是可以大力發(fā)展應(yīng)用的主要方法,高效無(wú)污染的生物防治技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)[2]。

大量實(shí)踐證明, 芽胞桿菌的穩(wěn)定性、與其他化學(xué)試劑的相容性和在不同果蔬不同年份防效的一致性等方面均明顯優(yōu)于非芽胞桿菌和真菌生防菌劑[3]。用蔗糖麩酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的Bacillusspp.BR-11 及BS-25皆可促進(jìn)其對(duì)白花芥藍(lán)黑斑病的抑制效果[4]。微生物制劑的組成成分會(huì)影響拮抗微生物的生物活性及儲(chǔ)架壽命[5],其中不同來(lái)源的碳氮是影響拮抗微生物抗生作用的重要因子,因此如何有效地提升微生物制劑的有效性及防治潛力,導(dǎo)入環(huán)境因子的調(diào)控,以建立一個(gè)利于拮抗微生物生長(zhǎng)及促其抗生物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)酵環(huán)境,是研發(fā)微生物制劑不可忽略的方面之一[6]。

本研究以白菜炭疽病菌為測(cè)試對(duì)象,對(duì)從小白菜根際土壤中分離得到的細(xì)菌與放線菌菌株進(jìn)行控病作用測(cè)試,以期篩選出有較高生防效果的菌株;同時(shí)對(duì)影響其生防作用發(fā)揮的培養(yǎng)條件進(jìn)行初步研究,為生防制劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

SuperGreen(SG),由安理科技公司(新北市)提供,為一種香蕉萃取物。

白菜炭疽病病菌(Colletotrichum higginsianum)菌株P(guān)A01,由中興大學(xué)植物病害管理實(shí)驗(yàn)室提供。

SYMA培養(yǎng)基由黃豆粉(20g)煮沸20min后的濾液,添加5g糖蜜(市售),加水至1L,瓊脂20g(無(wú)瓊脂則為SYM),pH7.5,再滅菌而成;幾丁質(zhì)培養(yǎng)基:2g膠狀幾丁質(zhì)(中興大學(xué)植物病害管理實(shí)驗(yàn)室自制)、瓊脂20g、K2HPO40.7g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、ZnSO40.001g,水1L,pH自然。

其他固體培養(yǎng)基包括:TSA、PDA、NA、ISP4,相應(yīng)液體培養(yǎng)基包括:TSB、PDB、NB、ISP4-A。均為美國(guó)DIFCO公司產(chǎn)品。

小白菜品種為‘鳳山5號(hào)’,種子為臺(tái)中市售,種植于日光溫室中,在3葉1心時(shí)挑選長(zhǎng)勢(shì)較為一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2菌株的誘導(dǎo)與分離

用SG500倍液澆透盆栽小白菜基質(zhì),一周后采集土樣。用幾丁質(zhì)、PDA等培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離,挑選菌落四周有不透明圈的放線菌、分解幾丁質(zhì)能力較強(qiáng)及數(shù)量較多的菌落,進(jìn)一步進(jìn)行純化培養(yǎng),每周用PDA平板畫線更新待用。

1.3分離菌株對(duì)白菜炭疽病菌的抑菌作用

先采用平板對(duì)峙法粗篩出有抑菌作用的菌株,再進(jìn)行精確測(cè)定。

取濃度為105個(gè)/mL的白菜炭疽病菌PA01分生孢子懸浮液10μL于PDA平板中央,在PA01兩側(cè)對(duì)稱的兩點(diǎn)分別接種兩株待測(cè)菌,與PA01相距2cm,待測(cè)菌濃度為107個(gè)/mL孢子(細(xì)胞)液,每點(diǎn)接10μL;以只接種菌株P(guān)A01為對(duì)照。各處理均為4個(gè)重復(fù)。30℃培養(yǎng)8d后,測(cè)量菌株P(guān)A01的菌落直徑。按如下公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100。

1.4HZB02 PDB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白菜炭疽病(菌)的控制效果

選用PDB培養(yǎng)液,將HZB02 于30℃、150r/min下培養(yǎng)5d,發(fā)酵液離心后過(guò)0.22μm濾膜除菌備用。

1.4.1對(duì)白菜炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響

設(shè)置無(wú)菌水(CK)、HZB02除菌發(fā)酵液的2×、10×、100×稀釋液共4個(gè)處理,每處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)隨機(jī)調(diào)查100個(gè)孢子的萌發(fā)狀況。

操作方法：取5μL105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子懸浮液與5μLHZB02發(fā)酵液在無(wú)菌玻片上混勻,置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中,于30℃下保濕培養(yǎng)。12h后檢查孢子萌發(fā)率、萌發(fā)孢子中未形成附著胞的百分比及其他抑制萌發(fā)的特征。

孢子萌發(fā)率(%)=(對(duì)照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對(duì)照組孢子萌發(fā)率×100。

1.4.2對(duì)白菜炭疽病的控制效果

取溫室中生長(zhǎng)有3葉1心的白菜植株,分別噴施清水、HZB02PDB發(fā)酵液10×、50×、100×稀釋液,待葉面干燥后噴霧接種105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子懸浮液,每盆接種孢子液10mL,保濕24h。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),每重復(fù)3株(盆)。

5d后調(diào)查各處理植株1～3葉發(fā)病狀況,計(jì)算各處理的病情指數(shù)和相對(duì)防效。各葉片發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，無(wú)發(fā)病,1級(jí)，發(fā)病率[0～0.07%],2級(jí)，發(fā)病率(0.07%～3%],3級(jí)，發(fā)病率(3%～10%],4級(jí)，發(fā)病率(10%～25%],5級(jí)，發(fā)病率(25%～50%],6級(jí)，發(fā)病率50%以上;1～5級(jí)的發(fā)病率上限不計(jì)在本級(jí)別內(nèi)[7]。

相對(duì)防效(%)=

1.5HZB02的鑒定

觀察HZB02在平板上的菌落形態(tài),用電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)與大小,再進(jìn)行種的分子鑒定。

分子鑒定通過(guò)微波法提取菌株DNA,擴(kuò)增引物為16S-F(5′-TTGTACACACCGCCCGTCA-3′)和23S-R(5′-GGTACCTTAGATGTTTCAGTTC-3′)[8]。反應(yīng)體系：兩種10μmol/L引物各0.4μL, 5×PCRMasterMix4μL, 模板DNA1μL，ddH2O14.2μL。擴(kuò)增條件：92℃ 5min;92℃ 60s,55℃ 60s,72℃ 60s,30個(gè)循環(huán);72℃ 5min;4℃保存。PCR產(chǎn)物測(cè)序由源資國(guó)際生物科技股份有限公司完成,再將該序列與美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),采用MAGE5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6不同培養(yǎng)基對(duì)HZB02抑菌作用的影響

1.6.1不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的HZB02對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

HZB02平板培養(yǎng)選擇SYMA、TSA、PDA、NA、ISP4等5種培養(yǎng)基。

取105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子懸浮液10μL于各平板中央,在與PA01相距2.5cm的對(duì)稱的兩點(diǎn)各接種106個(gè)/mLHZB02菌液10μL,每處理4個(gè)重復(fù)。30℃培養(yǎng)8d后,測(cè)量受各待測(cè)菌影響的PA01菌落直徑,同時(shí)觀察HZB02在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)及抑菌表現(xiàn)狀況。

1.6.2HZB02不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌的影響

菌株HZB02的發(fā)酵選用SYM、TSB、PDB、NB、ISP4-A(不含瓊脂)共5種培養(yǎng)基,在30℃,150r/min條件下培養(yǎng)5d。取各發(fā)酵液過(guò)0.22μm濾膜除菌備用。

1.6.2.1對(duì)孢子萌發(fā)的影響

設(shè)置無(wú)菌水CK、經(jīng)不同培養(yǎng)基發(fā)酵的HZB02除菌發(fā)酵液10×稀釋液共6個(gè)處理。每處理3個(gè)重復(fù),每重復(fù)隨機(jī)調(diào)查100個(gè)孢子的萌發(fā)狀況。

操作方法:將5μL105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子懸浮液與5μLHZB02發(fā)酵液在無(wú)菌玻片上混勻;每玻片上做3個(gè)重復(fù),置于保濕無(wú)菌培養(yǎng)皿中30℃下培養(yǎng);12h后檢查孢子萌發(fā)抑制率及抑制萌發(fā)特征。

1.6.2.2對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將各除菌發(fā)酵液與熔化的PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合均勻,以不加發(fā)酵液的PDA平板為對(duì)照,每處理4個(gè)重復(fù)。取105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子懸浮液10μL置于平板中央,30℃培養(yǎng),待對(duì)照組菌落基本長(zhǎng)滿平板時(shí)測(cè)定各處理菌落直徑。

1.6.3添加植物油的發(fā)酵液對(duì)抑菌作用的影響

設(shè)置SYM、PDB、TSB及分別添加0.5%(V/V)大豆油共6個(gè)處理,將各發(fā)酵液除菌后與PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合均勻,以不加發(fā)酵液的PDA平板為對(duì)照,每處理4個(gè)重復(fù)。取105個(gè)/mL菌株P(guān)A01分生孢子液10μL置于平板中央,30℃培養(yǎng),待對(duì)照組菌落基本長(zhǎng)滿平板時(shí)測(cè)定各處理菌落直徑。

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)各處理進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1分離菌株對(duì)白菜炭疽病菌的抑菌效果

從白菜根際土壤中共分離到25株細(xì)菌和16株放線菌。經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)初步篩選出2株細(xì)菌和5株放線菌對(duì)白菜炭疽病菌菌株P(guān)A01菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制效果;有6個(gè)菌株在PDA平板上不能良好生長(zhǎng),無(wú)法觀察其影響;其他菌株則沒(méi)有抑菌作用。

經(jīng)進(jìn)一步精確測(cè)定,細(xì)菌HZB02、放線菌HZS08具有極為顯著的抑制菌株P(guān)A01生長(zhǎng)的作用,抑菌率分別達(dá)到69.90%和63.15%;3個(gè)放線菌菌株HZS07、HZS10、HZS06抑制作用表現(xiàn)微弱;細(xì)菌HZB03、放線菌HZS16則無(wú)明顯作用(表1)。

表1　拮抗菌對(duì)白菜炭疽病菌的抑制作用篩選1)Table 1　Inhibitory effects of antagonistic HZB and HZSstrains on Colletotrichum higginsianum

1) 表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。下同。

DatainthesamecolumnfollowedbydifferentlowercaselettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P<0.05).Thesamebelow.

2.2HZB02 PDB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白菜炭疽病(菌)的控制效果

2.2.1對(duì)白菜炭疽病菌PA01孢子萌發(fā)的影響

HZB02除菌發(fā)酵液2×稀釋液對(duì)菌株P(guān)A01的孢子萌發(fā)率雖然沒(méi)有明顯的影響(表2),但萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲普遍出現(xiàn)腫大,萌發(fā)孢子中只有5.67%產(chǎn)生淺色的附著胞(圖1a);10×稀釋液處理的PA01其孢子萌發(fā)率為90.67%,顯著高于對(duì)照的80.00%,可能是除菌發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有促進(jìn)孢子萌發(fā)的作用,但萌發(fā)的孢子中僅7.00%有附著胞,且附著胞與萌發(fā)孢子基部的長(zhǎng)度普遍長(zhǎng)于孢子長(zhǎng)度3倍以上(圖1b);100×稀釋液處理的菌株P(guān)A01萌發(fā)率較CK高,且產(chǎn)生附著胞,與對(duì)照沒(méi)有顯著差異。

表2　HZB02 PDB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白菜炭疽病菌 孢子萌發(fā)的控制作用Table 2　Effects of fermentationproducts of HZB02 on conidial germination ofColletotrichum higginsianum in PDB medium

圖1　HZB02 PDB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白菜炭疽 病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Conidial germination of Colletotrichum higginsianum after the treatment with fermentation products of HZB02 in PDB medium

附著胞是炭疽菌產(chǎn)生的能穿透寄主組織的特殊侵染結(jié)構(gòu)[9],對(duì)其致病性有著重要影響。10倍稀釋液處理后雖然90.67%的白菜炭疽病菌孢子萌發(fā),但絕大多數(shù)不能正常形成附著胞。因此，以此為起點(diǎn),設(shè)置10×、50×和100×發(fā)酵液進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。

2.2.2對(duì)白菜炭疽病的控制效果

HZB02PDB發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病顯示出較好的控病作用(表3)。10×稀釋液的相對(duì)防效達(dá)到64.79%,50×和100×也分別達(dá)到31.19%和28.00%,顯示出較為理想的控病效果。10×稀釋液處理后葉片上出現(xiàn)邊緣模糊的褐色斑塊,其他2個(gè)低濃度處理未見(jiàn)此狀況,可能是因?yàn)楦邼舛葘?dǎo)致的“藥害”。

表3　HZB02 PDB發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白菜炭疽病的控制作用Table 3　Effects of fermentation products of HZB02 inPDB medium on anthracnose disease control

2.3HZB02的鑒定

在不同培養(yǎng)基平板上，HZB02的菌落顏色均為稍灰暗的乳白色,不規(guī)則形,邊緣鋸齒狀。在電子顯微鏡下可見(jiàn)菌體為短桿狀,兩端鈍圓,1.56(1.42～1.67)μm×0.78(0.73～0.87)μm(圖2)。

圖2　HZB02電鏡下形態(tài)(5 000×)Fig.2 Observation of HZB02 morphology under electron microscopy

HZB02菌株16SrDNA片段的序列鑒定及分析結(jié)果顯示,HZB02屬于Bacillus subtilissubsp. spizizenii,與菌株NRS231 (CP010434.1)、TU-B-10 (CP002905.1)、W23 (CP002183.1)的相似度達(dá)到99%(圖3)。

2.4不同培養(yǎng)基對(duì)HZB02抑菌作用的影響

2.4.1不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的HZB02對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同平板培養(yǎng)基上的HZB02對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)出顯著差異,在SYMA、PDA培養(yǎng)基上其抑制作用表現(xiàn)最為優(yōu)異,對(duì)白菜炭疽病菌菌絲抑菌率分別達(dá)到74.64%、69.99%,在NA、ISP4培養(yǎng)基上的抑菌率也達(dá)到50%以上,顯示出較強(qiáng)的抑菌作用和營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)能力(表4)。另外,在PDA平板上,白菜炭疽病菌被抑制處菌落表現(xiàn)出黑色、鋸齒狀特征,其他幾種培養(yǎng)基上則較為整齊,亦無(wú)顏色變化。

圖3　菌株HZB02 16S-23S rDNA 基因區(qū)間序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S-23S rDNA interval sequences of the strain HZB02 and its relatives

培養(yǎng)基 Medium抑菌率/% InhibitionrateSYMA(74.64±2.05)aTSA(32.03±3.47)ePDA(69.99±2.29)bISP4(53.88±2.08)dNA(59.26±2.49)c

2.4.2不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌的影響

2.4.2.1對(duì)孢子萌發(fā)的影響

HZB02不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵液10×稀釋液對(duì)白菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的影響有著較大的差異。從總體萌發(fā)率來(lái)看,SYM發(fā)酵液處理的白菜炭疽病菌只有34.0%的孢子萌發(fā),顯示出優(yōu)異的抑制孢子萌發(fā)的作用;其他幾種發(fā)酵液中白菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)率則都明顯高于對(duì)照的80.0%,均達(dá)到90%以上,可能是發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)的促進(jìn)作用;發(fā)酵液對(duì)附著胞形成的影響與對(duì)孢子萌發(fā)的影響相似,TSB、PDB發(fā)酵液處理的白菜炭疽病菌只有12.67%和29.00%具有附著胞(表5)。

2.4.2.2對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

利用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)HZB02得到的發(fā)酵液除菌后與熔化的PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合,對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用與對(duì)孢子萌發(fā)的影響有所不同。結(jié)果顯示,TSB培養(yǎng)的HZB02抑菌率最高,與其他幾種培養(yǎng)液差異顯著;SYM、PDB次之,NB、ISP4-A則與對(duì)孢子的影響一致,只有6.69%和6.00%(表6)。

表5　HZB02不同發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌 分生孢子萌發(fā)的影響Table 5　Effects of different fermentation products of HZB02on conidial germination of Colletotrichum higginsianum

表6　HZB02不同發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌 菌絲生長(zhǎng)的影響Table 6 Effects of different fermentation products ofHZB02 on mycelial growth of Colletotrichum higginsianum

2.4.3添加植物油的發(fā)酵液對(duì)抑菌作用的影響

3種培養(yǎng)基中添加5%大豆油的HZB02發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用不同。其中SYM、PDB中添加大豆油后抑菌率顯著提高,分別從29.91%提高到35.12%、30.68%提高到36.60%;但TSB添加大豆油后其抑菌能力反而下降了5百分點(diǎn)。

表7　添加大豆油的發(fā)酵液對(duì)白菜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響1)Table 7　Effects of the addition of soybean oil to fermentationproducts on mycelial growth of Colletotrichum higginsianum

1) 同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異。
Differentsmalllettersinthesamerowindicatesignificantdifferenceat0.05level.

3　討論

炭疽菌的分生孢子先附著于寄主表面,條件適合,產(chǎn)生芽管,繼而在其頂端形成附著胞,隨后侵入寄主表皮細(xì)胞[10]。因此,分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的高低成為病原菌侵染寄主成功與否的關(guān)鍵[11]。Bacillus subtilisHZB02多種發(fā)酵產(chǎn)物有明顯導(dǎo)致附著胞消失或黑色素減少的現(xiàn)象,這是由于培養(yǎng)基中殘存營(yíng)養(yǎng)的影響,還是特定的代謝產(chǎn)物的作用,以及該現(xiàn)象與對(duì)病害控制的關(guān)系有待深入研究。

生物農(nóng)藥的加工開(kāi)發(fā)中,通過(guò)液態(tài)培養(yǎng)進(jìn)行批量生產(chǎn)是最具經(jīng)濟(jì)效益的方法,許多培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時(shí)間等)對(duì)生物制劑功效的發(fā)揮有著重要的影響[12-13]。Bacillus subtilisHZB02總體表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌和控病能力,顯示出較好的生防應(yīng)用潛力。本研究測(cè)定了不同C源、N源的固體與液體培養(yǎng)基以及添加大豆油情況下培養(yǎng)的HZB02對(duì)白菜炭疽病菌的影響,結(jié)果表明,抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基有所不同,SYM、PDB的抑制孢子萌發(fā)作用最強(qiáng),而TSB則顯示出最優(yōu)的抑制菌絲生長(zhǎng)能力,HZB02制劑的最佳培養(yǎng)條件還需進(jìn)一步篩選優(yōu)化。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

IsolationofBacillus subtilisHZB02anditsantimicrobialeffect

ZhouXiaolin1,HuangJennwen2,LiuRenhao3,GeLei1,GuWeibing1

(1.NantongCollegeofScienceandTechnology,NantongKeyLaboratoryofPlantPestMonitoringandComprehensiveManagement,Nantong226007,China; 2.LaboratoryofPlantDiseasesManagement,ChungHsingUniversity,Taichung40227,China; 3.NantongShundeBiologicalsCo.,Ltd.,Nantong226000,China)

AbacterialstrainHZB02,whichishighlyantagonisticagainstColletotrichum higginsianum,wasisolatedandscreenedfromtherhizospheresoilofChinesecabbage‘Fengshan5’ (Brassica chinensisL.)whichwasdrenchedwithSupperGreen.ThestrainhadsignificantlyinhibitoryeffectonconidialgerminationandmycelialgrowthofC.higginsianum,aswellastheinfectionofBrassica chinensisL.bytheanthracnosefungusinthelaboratoryandgreenhouseexperiments.Accordingtotheresultsofmorphologicalcharacteristics,electronmicroscopicobservationand16SrDNAsequencehomology,thestrainHZB02wasidentifiedasBacillus subtilissubsp. subtilis.DifferentnutrientmediaandtheadditionofsoybeanoilforculturingHZB02werefurtherevaluatedforitsantibioticeffectsonthepathogen.TheresultsshowedthatthestrongestinhibitoryeffectonthemycelialgrowthofC.higginsianumwasobservedwhenHZB02andthefunguswereduallyculturedinSYMAandPDA.ConidialgerminationwasalsohighlyinhibitedbyfermentationproductsofHZB02inSYMandPDB.Moreover,theantimicrobialeffectofthestrainHZB02wasdramaticallyenhancedwhenitsculturalmediaSYMandPDBwereaddedwith5%(V/V)soybeanoil.

Bacillus subtilis;antagonisticbacterium;Colletotrichum higginsianum;antimicrobialeffect

2014-11-24

2015-02-15

江蘇省高校優(yōu)秀中青年教師和校長(zhǎng)境外研修項(xiàng)目(2011年度)；南通舜德生物制品有限公司和南通市植物有害生物監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供部分資金資助

E-mail:zxl700621@sina.com

S476

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.025