黑龍江地區向日葵核盤菌致病性分化研究

劉　佳,　張勻華,　孟慶林,　石鳳梅,馬立功,　李易初,　劉春來,　左豫虎

(1. 黑龍江八一農墾大學, 大慶　163319; 2. 黑龍江省農業科學院植物保護研究所, 哈爾濱　150086)

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黑龍江地區向日葵核盤菌致病性分化研究

劉佳1,2,張勻華2,孟慶林2,石鳳梅2,馬立功2,李易初2,劉春來2,左豫虎1*

(1. 黑龍江八一農墾大學, 大慶163319; 2. 黑龍江省農業科學院植物保護研究所, 哈爾濱150086)

本文對黑龍江省的100株向日葵核盤菌(39個親和組)的致病力、菌落生長速率、草酸產量及總酸產量(pH)進行了測定,并分析了菌株致病力與菌落生長速率、草酸產量及總酸產量(pH) 3個因子的相關性。結果表明: 菌株的致病力與草酸產量成正相關(r=0.758,P<0.01);與總酸產量(pH)之間成負相關(r=-0.794,P<0.01);草酸產量與總酸產量(pH)之間呈顯著負相關關系(r=-0.639,P<0.01)。

核盤菌;致病性;向日葵;相關性

(1.HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China; 2.InstituteofPlantProtection,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)

核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)deBary]是一種世界性分布的病原真菌,寄主范圍非常廣,能對油菜、向日葵、大豆、胡蘿卜、擬南芥等超過400種作物造成不同程度的危害[1]。歷史上菌核病曾導致中國內蒙古地區向日葵[2]、愛爾蘭馬鈴薯[3]、加拿大豆類作物[4]大面積受侵染,尤其是1985年-1987年間,我國黑龍江省的一般地塊向日葵菌核病發病率達到30%～60%,嚴重地塊達到90%以上,甚至絕產[5],造成嚴重的經濟損失。2009年—2014年,黑龍江省農業科學院植物保護研究所對黑龍江省向日葵產區菌核病的發生情況進行了連續6年的實地調查,結果顯示菌核病的年平均發病率在30%～50%,有些地塊發病率達到80%以上。對于這種具有廣泛地理分布的病原菌種群內是否存在致病性分化,前人已有一些研究,有報道表明不同核盤菌菌株的致病性沒有質的分化,也有學者認為該病原菌種群內不同菌株間存在致病性分化[6-9]。本研究僅對黑龍江省內的100株核盤菌(39個親和組)的致病力、菌落生長速率、草酸及總酸含量進行測定,并探討菌株致病力與菌落生長速率、草酸產量及總酸產量(pH)3個因子間的相關性,明確黑龍江省內核盤菌種群內是否存在致病性分化,以及這種分化與菌株來源是否有關,從而為黑龍江省向日葵菌核病的防治和抗病育種提供依據。

1　材料與方法

1.1核盤菌菌株致病力測定

1.1.1供試向日葵品種

抗病品種‘豐葵雜1號’,由黑龍江省農業科學院植物保護研究所免疫室提供 。

1.1.2供試菌株

對采自黑龍江省10個地區29個市縣5種寄主的100個菌株經過菌絲融合群試驗進行了親和分組測定,共分成39個親和組(見表1)。

1.1.3菌株培養

將活化好的核盤菌菌株接種到PDA培養基上,放于25℃恒溫培養箱中黑暗培養,待菌落生長至培養皿直徑的80%時備用。

1.1.4離體葉片法測定核盤菌對‘豐葵雜1號’的致病性

取長方形塑料盤,用75%乙醇棉擦拭盤面,在盤底部鋪兩層滅菌的濕潤濾紙。取苗齡為30d、長勢及面積較為一致的‘豐葵雜1號’葉片,自來水沖洗干凈,用吸水濾紙吸干葉片上多余水分,然后將葉片均勻地置于塑料盤內濕潤濾紙上,葉片背面朝上。用打孔器在菌落的邊緣打取直徑4mm的菌絲塊接種在葉片主葉脈的兩側,每處理3個葉片,每個葉片接種1個菌絲塊,以沒有接菌的瓊脂塊作為對照。接種后,用保鮮膜封住塑料盤,置于恒溫培養箱中培養(23～25℃)。48h后觀察發病情況并拍照,用十字交叉法量取病斑直徑大小。數據采用SPSS11.5軟件進行方差分析。

表1　親和組所含菌株及來源Table 1　Strains in mycelial compatibility groups and its source

1.2核盤菌的不同親和組菌落生長速率測定

將純化的菌株接入含50mg/L溴酚藍(BPB)的PDA平板上,培養2～3d后,于菌落邊緣打取7mm的菌碟,轉至含50mg/LBPB的PDA平板的中央,接種后的培養皿用封口膜封好,放于恒溫培養箱中 23～25℃黑暗培養48h后,測量菌落直徑,各菌株重復3次,以確定不同菌落生長速率的差異。

1.3菌株產草酸(OA)能力和pH測定

于菌落邊緣打取7mm的菌碟,轉至30mLPDB中(含2%葡萄糖和0.4%馬鈴薯汁),室溫靜止培養3d。真空抽濾,得到的菌絲體在鼓風干燥箱中干燥至恒重,并測得菌絲體的干重。上清液用于OA和pH(用pH計)的測定。

反應液的配制:0.2mL樣品液,0.11mLBPB(1mmol/L),0.198mL硫酸(1mol/L),0.176mL重鉻酸鉀(100mmol/L),4.8mL蒸餾水。

將混合物放入60℃的水浴鍋中,10min后,用0.5mL(1.0mol/L)氫氧化鈉溶液終止反應。測定600nm處的吸光值,以PDB溶液作為對照。通過標準曲線計算出OA含量(μg草酸/mg干菌絲)。

2　結果與分析

2.1不同親和組核盤菌致病力測定結果

利用菌碟貼接離體向日葵葉片,經保濕培養,12h后在葉片上出現明顯的水浸狀病斑,隨保濕時間的延長病斑生長迅速。如表2所示,侵染48h后MCG27(46.2mm)和MCG39(45.1mm)的病斑直徑較大;MCG28(37.5mm)和MCG1(34.4mm)的病斑直徑居中;而MCG21(10.8mm)和MCG31(9.0mm)的病斑直徑較小,不同親和組間病斑直徑的變化范圍為9.0～46.2mm,最大差幅達到37.2mm。經過方差分析可知MCG27和MCG39顯著高于MCG28,及病斑直徑小于MCG28的所有親和組,極顯著高于MCG1,及病斑直徑小于MCG1的所有親和組。另外，通過測定結果可以看出不同親和組間致病力的差異與菌株的地理來源無關。

表2　不同親和組核盤菌菌株在向日葵葉片上產生的病斑直徑(48 h)1)Table 2　Lesion diameters produced by different MCGs Sclerotinia sclerotiorumstrains on the sunflower leaves 48 hours after inoculation

1) 同列不同小寫英文字母代表在0.05水平有顯著差異,不同大寫字母代表在0.01水平有極顯著差異;下同。Differentlowercaselettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceat0.05level;differentcapitallettersindicateextremelysignificantdifferenceat0.01level.Thesamebelow.

2.2核盤菌不同親和組菌落平均生長速率的差異

供試菌株親和組在PDA(含BPB)培養基上培養后,菌絲均生長迅速,但不同親和組之間存在較大差異。如表3所示,培養48h后,MCG24(86.6mm)和MCG26(85.7mm)的菌落直徑較大;MCG32(74.7mm)和MCG19(71.7mm)的菌落直徑居中;而MCG21(22.7mm)和MCG36(23.1mm)的菌落直徑較小,不同親和組群間菌落直徑的差別范圍是22.7～86.6mm,最大差幅達到63.9mm。經過方差分析可知MCG24和MCG26顯著高于MCG32及菌落直徑小于其的所有親和組;極顯著高于MCG19及菌落直徑小于MCG19的所有親和組。同時通過測定結果可以看出不同親和組間菌落生長速率的差異與菌株的地理來源無關。

表3　不同親和組核盤菌菌株在PDA培養基上培養48 h后菌落平均直徑Table 3　Colony diameters of different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs cultured on PDA for 48 hours

2.3菌株親和組產草酸(OA)能力和pH

如表4所示,從菌株親和組間看,MCG31產草酸量最小,為3.84μg/mg干菌絲,MCG39產草酸量最大,為27.56μg/mg干菌絲。親和組間草酸產生能力差別較大,其中MCG39、MCG30、MCG27、MCG22的產草酸量都超過了20μg/mg干菌絲;MCG36、MCG9、MCG38、MCG31的產草酸量都低于5μg/mg干菌絲。方差分析結果表明各不同親和組之間存在顯著差異。同時,研究發現菌株產生草酸能力的差異不僅出現在親和組間,也出現在親和組內。

表4　不同親和組核盤菌菌株在PDB培養液中草酸產量Table 4　Oxalic acids production produced by different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs in PDB media

菌株在液體培養的過程中除產生草酸外,還可能產生其他未知酸類物質,致使培養液的pH產生很大的變化。由表5可知,接入菌后培養液的pH最小達到了3.64(MCG39),最高為4.83(MCG31),經測定未接入菌碟前原始培養液(CK)的平均pH為5.03。如果利用pH的變化來衡量親和組間產生的總酸產量時,在不同親和組間總酸的產量也呈現出顯著性差異,方差分析結果表明，MCG31、MCG9、MCG38和MCG10的pH顯著高于MCG1及pH小于MCG1的所有親和組;極顯著高于MCG26及pH小于MCG26的所有親和組。

表5　不同親和組核盤菌菌株在PDB培養液中產生的總酸量Table 5　Total acid production produced by different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs cultured in PDB media

2.4與致病力有關的3個因子的相關性分析

通過對與致病力有關的菌落生長速率、草酸產量及總酸產量(pH)3個因子進行相關性分析表明,菌株的致病力與草酸產量成正相關(r=0.758,P<0.01);與總酸產量(pH)之間成負相關(r=-0.794,P<0.01);草酸產量與總酸的pH之間呈顯著負相關(r=-0.639,P<0.01),證明了 S.sclerotiorum分泌的總有機酸里主要成分是草酸。

表6　不同菌絲親和組間病斑直徑、菌落生長速率、草酸量、總酸的相關性分析1)Table 6　Correlation analysis among lesion diameter of Sclerotinia sclerotiorum isolates, colony growth rate,oxalic acid production and total acid from different MCGs

1)*代表相關顯著性水平P<0.05;**代表相關顯著性水平P<0.01。

*: P<0.05;**: P<0.01.

3　結論與討論

病原物在與寄主共進化的過程中,其致病性也在不斷分化,到目前為止,已經發現小麥銹菌、黑粉菌、白粉菌,水稻稻瘟病菌等存在致病性分化,而對于核盤菌種群內有無致病性分化,迄今尚無肯定的結果[10-11]。Anderson等人對阿根廷160個S.sclerotiorum菌株的50 個MCGs在離體芹菜莖接種測定其致病性的研究中發現,菌絲親和組之間的致病力沒有差異[12-13];劉春來對采集于內蒙古和黑龍江省不同地區的20個向日葵核盤菌分離物進行了致病性測定,結果表明不同來源核盤菌菌株間致病性存在著顯著差異,且這種致病性分化與菌株來源沒有明顯的相關性[14],也有學者指出向日葵核盤菌菌株在不同寄主上的致病特異性應該是它與寄主長期相互作用的結果,它們相互作用的時間越長,其特異性可能越明顯,同時在同一寄主上的菌株其致病性也存在分化現象[7]。王玉杰對不同親和組核盤菌致病性與草酸、總酸、多聚半乳糖醛酸酶及菌落生長速率進行相關性分析,結果表明菌株致病力與草酸、多聚半乳糖醛酸酶成正相關,與總酸的pH成負相關,而與菌落生長速率無關[15]。

本文對采自黑龍江省10個地區29個市縣5種寄主的100個菌株(39個親和組)進行了比較研究,親和組間菌落的生長速率達到了顯著性差異,同時發現來源于同一地區間、不同地區間及親和組內的菌株菌落生長速率的差異很大,說明菌株的生長速度呈現出多樣性,并與地理來源無關,親和組間致病力的差異未發現與菌株的地理來源有關。通過相關性分析表明,菌株的致病力與草酸產量呈正相關,與總酸產量(pH)之間呈負相關,與菌落的生長速率無關;草酸產量與總酸的pH之間呈顯著負相關。

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(責任編輯：楊明麗)

DifferentiationinpathogenicityofSclerotinia sclerotiorum

onsunflowerinHeilongjiangProvince

LiuJia1,2,ZhangYunhua2,MengQinglin2,ShiFengmei2,MaLigong2,LiYichu2,LiuChunlai2,ZuoYuhu1

Thepathogenicity,colonygrowthrate,oxalicacidproductionandtotalacid(pH)of100sunflowerSclerotinia sclerotiorumstrainsbelongto39mycelialcompatibilitygroupsfromdifferentregionsofHeilongjiangProvinceweremeasured.Thecorrelationbetweenpathogenicityandcolonygrowthrate,oxalicacidproduction,totalacid(pH)wereanalyzed.Theresultsshowedthatlesiondiameterofsunflowerleavesafterinoculationhadapositivecorrelationwithoxalicacid(r=0.758, P<0.01),buthadanegativecorrelationwiththetotalacid(pH)value(r=-0.794, P<0.01).Oxalicacidproductionalsowasnegativelycorrelatedtothetotalacid(pH)value(r=-0.639, P<0.01).

Sclerotinia sclerotiorum;pathogenicity;sunflower;correlation

2014-11-17

2014-12-22

國家現代農業(向日葵)產業技術體系(CARS-16)

E-mail:zuoyhu@163.com

S435.655

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.021