禾谷炭疽菌CFEM效應子的生物信息學鑒定與轉錄分析

井忠英,　王國梁,　劉文德

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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禾谷炭疽菌CFEM效應子的生物信息學鑒定與轉錄分析

井忠英,王國梁*,劉文德*

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

植物病原真菌效應子是指可以改變寄主植物細胞結構或者細胞功能的分泌蛋白或其他小分子物質。效應子對病原真菌的侵入、擴展以及致病發揮著至關重要的作用,是植物病原真菌與寄主的互作不斷演化的必然結果。真菌特有的CFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)蛋白對于病原真菌的致病性起重要作用,一些能夠被分泌到胞外的CFEM蛋白被證明是病原真菌效應子。由禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)引起的玉米炭疽病是玉米上的重要病害,常年造成嚴重損失。本研究運用生物信息學工具對禾谷炭疽菌中的CFEM蛋白進行信號肽分析和亞細胞定位分析,進而通過轉錄分析明確禾谷炭疽菌CFEM蛋白的表達時期。分析結果表明,該病原真菌編碼32個CFEM蛋白,其中22個具有信號肽并可分泌至胞外,為分泌蛋白。轉錄分析表明,10個CFEM分泌蛋白于病菌侵染時附著胞形成期表達,2個CFEM分泌蛋白于侵染后的活體寄生階段表達,1個于死體寄生階段表達,其余9個CFEM分泌蛋白在病菌侵染時期的3個階段均穩定表達。結合生物信息學和轉錄分析結果,我們預測這22個CFEM分泌蛋白為禾谷炭疽菌致病相關的效應子(簡稱CFEM效應子)。明確禾谷炭疽菌中CFEM蛋白數量,預測病菌致病相關的CFEM效應子組成,可為開展病原真菌CFEM蛋白介導的病菌—寄主互作研究奠定基礎,并為玉米炭疽病的防治和抗性育種研究提供參考。

禾谷炭疽菌;CFEM效應子;生物信息學分析

玉米是世界三大作物之一,也是目前中國第一大糧食作物。每年作物病害都會造成嚴重的經濟損失,直接威脅世界糧食安全[1-3]。據統計,玉米絲黑穗病以及大斑病、小斑病是危害我國玉米生產的3種主要病害,但隨著耕作方式的轉變以及全球氣候、生態的改變,十余種次要病害逐年加重[4-5],部分病害有上升為主要病害的趨勢,已成為制約玉米生產的重要因素。目前玉米炭疽病已在我國各玉米種植區普遍發生,其病原菌是半活體寄生菌禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola),其侵染階段分為附著胞形成期、活體寄生和死體寄生3個階段。該病原真菌僅危害玉米,不危害其他禾本科作物[6-7]?；蚪M學和分子生物學的快速發展以及2008年該菌全基因組信息的公布,極大地促進了禾谷炭疽菌—玉米的互作研究,為揭示病原菌的侵染致病機制和寄主植物的抗病反應機理,以及制定該病害的有效防控措施奠定了基礎。

病菌效應子在病原真菌和寄主的互作中發揮著至關重要的作用,其直接影響病菌的侵入、擴展蔓延和病害發生[8-10]。病原真菌效應子主要為病菌分泌蛋白,少部分為病菌分泌的其他小分子物質,由病菌分泌至寄主細胞間或細胞內[11],繼而與寄主相應靶標互作,引起寄主細胞結構或功能的改變[12]。病原真菌效應子一般具有如下3方面特征:(1)一般通過胞吐的方式由病菌分泌至體外,故效應子N端氨基酸序列具有信號肽[11,13];(2)真菌效應子一般不具有膜蛋白的跨膜螺旋結構域及GPI(glycosylphosphatidyli-nositol)錨定位點;(3)效應子一般在病原真菌侵染階段表達,尤其是活體或死體寄生階段[14]。

CFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)蛋白僅存在于真菌中,且常見于真菌的胞外膜蛋白[15],并因此而得名。該蛋白結構域約有60個氨基酸,共有8個半胱氨酸。研究證實CFEM蛋白與病菌致病性密切相關,白假絲酵母(Candida albicans)[16]以及粗球孢子菌(Coccidioides immitis)[17]等病原真菌中均已發現致病相關的CFEM蛋白。半活體寄生菌稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)已發現致病相關的CFEM效應子[18],但目前尚無禾谷炭疽菌(C.graminicola)致病相關CFEM效應子的報道。因此,本文利用生物信息學方法分析禾谷炭疽菌CFEM蛋白。通過對CFEM蛋白進行信號肽分析,亞細胞定位分析,結合轉錄分析結果,預測禾谷炭疽菌CFEM效應子組成,將為進一步研究該菌CFEM效應子的功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

利用已發表的稻瘟菌(M. oryzae)胞外受體信號分子CFEM蛋白ACI1[19]的CFEM結構域氨基酸序列進行Blastp(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索禾谷炭疽菌全基因組數據庫(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html)。根據是否存在CFEM結構域的典型特征,共鑒定到32個C.graminicolaCFEM蛋白,并從禾谷炭疽菌全基因組數據庫中調取這32個CFEM蛋白的氨基酸序列,供進一步的生物信息學分析。

試驗所用玉米品種‘Mo17’由中國農業科學院作物科學研究所王曉鳴研究員提供。禾谷炭疽菌(C.graminicola)M2菌株由美國TexasA&MUniversity的MartinDickman教授惠贈。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析

使用ExPASy平臺的在線軟件SignalP4.1Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TargetP1.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分別預測蛋白質氨基酸序列的N端信號肽和亞細胞定位。按要求輸入fasta格式的32個氨基酸序列,N信號肽分析選擇默認設置,而亞細胞定位分析時organismgroup選擇non-plant,其他為默認設置。

1.2.2轉錄分析

玉米‘Mo17’3葉1心期為最佳接種時期,菌株M2孢子濃度為(5～6)× 105個/mL,分別于接種后20h(附著胞形成階段,PA)、36h(活體寄生階段,BP)、64h(死體寄生階段,NP)取樣。提取野生型禾谷炭疽菌M2侵染時期表達RNA,反轉錄為cDNA,RT-PCR擴增獲得3個表達時期的CFEM蛋白基因。RNA提取及反轉錄為cDNA的方法按O′Connell等[20]所述,所有CFEM蛋白基因克隆片段均構建至Peasy-T載體(購自北京全式金生物技術有限公司)并送北京六合華大基因科技有限公司測序,測序結果與基因注釋完全一致。所有引物皆由北京六合華大基因科技有限公司合成;RNA提取方法參見QIGEN公司RNeasePlantMinikit試劑盒使用說明;反轉錄參見Promega公司M-MLV反轉錄體系說明。

2　結果與分析

2.1禾谷炭疽菌CFEM蛋白信號肽分析

信號肽是分泌蛋白的基本特征。因此,本文首先對禾谷炭疽菌中所有的CFEM蛋白信號肽預測,初步確定禾谷炭疽菌CFEM分泌蛋白的組成。由SignalP4.1Server在線軟件對該菌CFEM蛋白進行信號肽預測分析的結果顯示,32個CFEM蛋白中有22個CFEM蛋白N端氨基酸序列具有信號肽,其信號肽序列為N端15～28個氨基酸(表1)。信號肽可引導蛋白精確地定位于胞內線粒體、葉綠體或通過分泌系統分泌至胞外[21]。因此,需進一步明確CFEM蛋白的亞細胞定位,從而排除胞內CFEM蛋白或膜蛋白。

表1　禾谷炭疽菌CFEM蛋白信號肽分析1)Table 1　Bioinformatic analysis of signal peptide of CFEM proteins in Colletotrichum graminicola

1) +表示該基因表達的蛋白具有信號肽；-表示該基因表達的蛋白不具有信號肽。

+indicatestheproteinhassignalpeptidesequences;-indicatestheproteinhasnosignalpeptidesequences.

2.2禾谷炭疽菌CFEM蛋白亞細胞定位分析

繼信號肽分析之后,本文利用TargetP軟件對22個具信號肽CFEM蛋白進行亞細胞定位分析,進一步明確CFEM胞外分泌蛋白的組成。預測結果表明,22個具有信號肽CFEM蛋白通過分泌途徑分泌至胞外的得分值≥0.672。其中,除GLRG_08904.1、GLRG_10834.1定位可信度略低(RC=4)外,其余20個CFEM蛋白的定位預測可信度皆較高(RC≤2)。因此,22個具有信號肽CFEM蛋白均為分泌蛋白,可通過禾谷炭疽菌分泌途徑分泌至胞外(表2)。

表2　22個具信號肽的CFEM蛋白的亞細胞定位預測分析1)Table 2　Subcellular localization prediction of CFEM proteins in Colletotrichum graminicola

續表2Table2(Continued)

蛋白序列號ProteinID細胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluesmTPSPOtherLocRC蛋白序列號ProteinID細胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluesmTPSPOtherLocRCGLRG_06380.10.0560.8620.039S1GLRG_10780.10.0370.9740.021S1GLRG_06414.10.0190.9700.046S1GLRG_10834.10.0630.6720.316S4GLRG_08253.10.1140.7930.034S2GLRG_10885.10.0370.9550.042S1

1) RC:可信度等級,估算亞細胞定位預測最大值和次值之間的差距(diff)。RC=1～5,1:diff≥0.800;2:0.800>diff≥0.600;3:0.600>diff≥0.400;4:0.400>diff≥0.200;5:diff<0.200。RC值越低,定位越準確,RC=1定位預測最可靠。mTP:線粒體定位;S:分泌途徑;SP:該蛋白含有信號肽,可通過分泌途徑分泌至胞外,為分泌蛋白;Other:其他定位;Loc:預測定位結果。
RC:Reliabilityclass,from1to5,where1indicatesthestrongestprediction. RCisameasureofthesizeofthedifference(diff)betweenthehighest(winning)andthesecondhighestoutputscores.Thereare5reliabilityclasses,definedasfollows: 1, diff ≥ 0.800; 2, 0.800 > diff ≥ 0.600; 3, 0.600 > diff ≥ 0.400; 4, 0.400 > diff ≥ 0.200;5, diff<0.200.Thus,thelowerthevalueofRC,thesafertheprediction;mTP:Mitochondrionlocalization,i.e.thesequencecontainsmTP,amitochondrialtargetingpeptide;S:Secretionpathway;SP:Signalpeptide;Other:Anyotherlocalization;Loc:Predictionoflocalization.

2.3禾谷炭疽菌CFEM分泌蛋白的轉錄分析

禾谷炭疽菌侵染玉米的過程可以分為3個階段,分別是“附著胞形成階段(in plantaappressoria,PA)、活體寄生階段(biotrophicphase,BP)、死體寄生階段(necrotrophicphase,NP)”。已知病原真菌侵染階段表達的分泌蛋白更有可能與病菌的致病密切相關,為此,繼亞細胞定位分析之后,我們對已鑒定的禾谷炭疽病菌22個CFEM分泌蛋白做相應的轉錄分析,即利用病原真菌接種寄主植物,獲取侵染時期3個階段的RNA和cDNA,繼而借助RT-PCR分析所有CFEM分泌蛋白的表達情況。RT-PCR分析結果表明,9個CFEM分泌蛋白在禾谷炭疽菌3個時期均有表達;10個CFEM分泌蛋白在禾谷炭疽菌侵染玉米過程的附著胞形成階段特異表達;GLRG_08904.1、GLRG_09163.1在禾谷炭疽菌形成初級侵染菌絲的活體寄生階段特異表達;GLRG_05629.1在禾谷炭疽菌形成次級侵染菌絲、誘導寄主細胞凋亡的死體寄生階段特異表達(表3)。因此,22個CFEM分泌蛋白皆可在禾谷炭疽菌侵染階段表達,我們預測這22個基因均為禾谷炭疽菌CFEM效應子。

表3　CFEM效應子轉錄分析1)Table 3　Transcriptional analysis of Colletotrichum graminicola CFEM effectors

1)PA:附著胞形成階段表達的CFEM效應子;BP:活體寄生階段表達的CFEM效應子;NP:死體寄生階段表達的CFEM效應子;ALL:以上3個階段均表達的CFEM效應子;+表示效應子在該時期表達。

PA:In plantaappressoriumphase;BP:Biotrophicphase;NP:Necrotrophicphase;ALL:Allthesethreeinfectionphase,includingPA,BPandNP;+meansthiscandidateeffectorexpressedinthisphase.

3　討論

病原真菌與寄主植物的互作一直是近年來的研究熱點,其中效應子誘導的免疫反應ETI(effector-triggeredimmunity)和效應子誘導的感病反應ETS(effector-triggeredsusceptibility)的研究報道尤其之多。禾谷炭疽菌侵染寄主植物時,其附著胞在病原真菌侵染初期吸附于寄主植物表面,通過膨壓直接穿透寄主表面;隨后病原真菌的侵染菌絲(初級侵染菌絲及次級侵染菌絲)在寄主細胞內蔓延擴展,通過分泌大量的效應子對寄主的生理生化免疫防衛反應起到直接干擾作用,阻礙寄主相應受體靶標的功能執行,進而導致寄主免疫防衛體系紊亂,誘發ETS[22]。因此,效應子研究可以明晰病原真菌與寄主互作機理,為抗病育種和病害防治提供理論指導。

據報道,半活體寄生菌稻瘟菌約含61個CFEM蛋白[23],研究表明PTH11[24-26]、ACI1[19,27]及MoCDIP2[18]這3個CFEM基因均于附著胞形成期表達。ACI1為胞外受體信號分子,通過與MAC1的互作,參與cAMP信號傳遞,直接影響附著胞的形成,但與稻瘟菌營養生長和致病性無關[27]。與之相反,PTH11作為附著胞及芽管胞內信號分子[24]與附著胞的形成無關[25],而與稻瘟菌的致病性密切相關[24,26];MoCDIP2可誘導寄主細胞凋亡[18],是目前唯一鑒定到的稻瘟菌CFEM效應子。此外,研究證實白假絲酵母(C.albicans)的CFEM蛋白CSA1及粗球孢子菌(C.immitis)的CFEM蛋白AG2均為膜蛋白,能夠調節菌絲生長及其致病性[16-17]。因此,推測CFEM蛋白可能為真菌細胞表面受體或信號分子,承接信號傳遞,從而影響真菌致病性。

隨著基因組預測的快速發展,生物信息學分析逐漸成為一門基于計算機學、數學、物理學、生物學的交叉學科,在序列同源性分析、二級或三級結構域分析以及功能預測方面發揮重要作用,基于生物信息學分析的研究亦與日俱增[28-31],極大地促進了病原真菌效應子的預測和研究。禾谷炭疽菌是半活體寄生菌研究的模式物種,然而,尚無相關CFEM效應子的報道。因此,CFEM效應子功能的解讀有助于加快病菌-寄主互作機理的研究步伐。效應子各具特色,無明顯的結構特征。除Fusarium oxysporumf.sp. lycopersici中的Six1[32]外,同一屬不同種的效應子亦不盡相同。但只要病原菌可以分泌該蛋白質至體外，并且該蛋白可影響寄主植物的生理反應，干擾寄主的免疫防衛反應，即是效應子。因此,信號肽成為效應子評判的重要指標[14]。因此,本文首先利用SignalP軟件分析禾谷炭疽菌中32個CFEM蛋白,確定禾谷炭疽菌共有22個具信號肽CFEM蛋白。其次,利用TargetP軟件分析是否所有的具信號肽CFEM蛋白皆可分泌至胞外,從而影響病菌與寄主的互作。Lee等及陳繼圣等已用TargetP軟件預測稻瘟菌(M. oryzae)和假絲酵母(C.albicans)基因組中的分泌蛋白,其預測結果與實際基本一致[21,33]。我們綜合信號肽分析和亞細胞定位分析兩方面的預測結果,推測禾谷炭疽菌C.graminicola共有22個CFEM分泌蛋白。然而,并非所有的分泌蛋白都與病菌的致病性相關,研究證實侵染階段表達的分泌蛋白更有可能影響病菌致病性,即更有可能為效應子[14]。我們通過RT-PCR技術,確定禾谷炭疽菌(C.graminicola)22個CFEM分泌蛋白均在病菌的侵染階段表達。其中,GLRG_08904.1、GLRG_09163.1以及GLRG_05629.1分別于病菌的活體寄生階段和死體寄生階段表達,與病菌的致病性關系可能更為密切。鑒于以上3個方面的分析,預測禾谷炭疽菌中存在22個CFEM效應子。本研究利用生物信息學的方法對禾谷炭疽菌所有CFEM蛋白質進行預測和分析,將為后續的功能研究(通過酵母蛋白分泌系統分析、基因敲除和突變體接種、煙草瞬時表達系統進行細胞凋亡篩選等試驗)奠定堅實的基礎。

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(責任編輯：楊明麗)

BioinformaticidentificationandtranscriptionalanalysisofColletotrichum graminicolaCFEMeffectorrepertoires

JingZhongying,WangGuoliang,LiuWende

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Fungaleffectorsaresecretedproteinsorothermoleculesthatcanalterhostcellstructureandfunctions.Theyplayacrucialroleinfungalpathogenesisandaretheweaponsfrompathogensforthecontinuousbattlewithhostplants.Untilnow,itisunclearhowtheCFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)proteinsandeffectorsconstituteinColletotrichum graminicola,thecausalagentofmaizeanthracnosedisease.Inthisstudy,weperformedasystematicalbioinformaticandtranscriptionalexpressionanalysisoftheCFEMeffectorrepertoiresencodedintheC.graminicolagenome.Weidentified32 C.graminicolaCFEMproteins,with22CFEMsecretedproteinswhichshowedvariousexpressionpatternsatdifferentinfectionstages.Amongthesesecretedproteins, 10proteinsexpressedinin-plantaappressoriumstage,twoexpressedinbiotrophicstage,oneexpressedinnecrotrophicstage,andothernineexpressedinallofthesethreestages.Finally,weproposedthatthese22CFEMsecretedproteinsarecandidateeffectorsinC.graminicola.OurfindingsprovideasolidfoundationforthefutureinvestigationofCFEMeffectormediatedpathogen-hostinteraction,andalsowillfacilitatemaizeanthracnosepreventionandcontrolanddiseaseresistancebreeding.

Colletotrichum graminicola;CFEMeffector;bioinformaticanalysis

2014-12-10

2015-03-03

植物病蟲害生物學國家重點實驗室開放課題(SKLOF201508)

E-mail:wang.620@osu.edu;liuwende@caas.cn

S435.131.4

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.014