中國(guó)柑橘大實(shí)蠅遺傳多樣性分析

高立志,　劉映紅*,　萬(wàn)宣伍,　涂祖霞,　蒲　頗,　陳　媛

(1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 重慶　400716; 2. 四川省植物保護(hù)站, 成都　610041; 3. 重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校, 重慶　401329)

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中國(guó)柑橘大實(shí)蠅遺傳多樣性分析

高立志1,劉映紅1*,萬(wàn)宣伍2,涂祖霞3,蒲頗1,陳媛1

(1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 重慶400716; 2. 四川省植物保護(hù)站, 成都610041; 3. 重慶市農(nóng)業(yè)學(xué)校, 重慶401329)

利用4對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)采自中國(guó)7省市的18個(gè)柑橘大實(shí)蠅地理種群進(jìn)行標(biāo)記,并進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,從供試柑橘大實(shí)蠅地理種群檢測(cè)到的等位基因數(shù)為19～30個(gè),平均為23.06個(gè),且4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(Bp125、BcuF 1.6、Bcac 5.10、Bcac 6.10)的等位基因數(shù)分別為7、14、9、8個(gè)。對(duì)18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的哈迪—溫伯格平衡測(cè)試結(jié)果顯示,其卡方值的變化范圍為5.582～∞,各種群間差異顯著(變化范圍為0.000～0.694)。表明中國(guó)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性較高,且不同種群間存在較大的遺傳分化。

柑橘大實(shí)蠅;微衛(wèi)星標(biāo)記;等位基因;遺傳多樣性

柑橘大實(shí)蠅[Bactroceraminax(Enderlein)],又名中國(guó)果實(shí)蠅,俗稱(chēng)“柑蛆”,隸屬于雙翅目(Diptera)、實(shí)蠅科(Tephritidae)、果實(shí)蠅屬(BactroceraMacquart),專(zhuān)性為害柑橘類(lèi)果實(shí),是該類(lèi)水果上的重要害蟲(chóng)之一[1-6]。目前,柑橘大實(shí)蠅主要在中國(guó)的湖南、湖北、四川、重慶、陜西、貴州和廣西等7省、市、自治區(qū)發(fā)生危害,柑橘大實(shí)蠅主要以幼蟲(chóng)蛀果為害,藥物噴灑防治極其困難,因此給果農(nóng)造成了巨大的損失。而傳統(tǒng)的農(nóng)藥化學(xué)防治收效甚微,故分析研究柑橘大實(shí)蠅種群間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,對(duì)柑橘大實(shí)蠅防控措施的制定具有重要的指導(dǎo)意義。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柑橘大實(shí)蠅的研究主要集中在其生態(tài)行為學(xué)和防治方法上,有關(guān)柑橘大實(shí)蠅分子生物學(xué)研究甚少,張彬等測(cè)定了柑橘大實(shí)蠅線粒體基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)柑橘大實(shí)蠅的線粒體基因共分為 21片段,總長(zhǎng)度為16 043 bp[15-16];高立志等通過(guò)近緣物篩選的方法篩選出了可用于柑橘大實(shí)蠅標(biāo)記的6對(duì)微衛(wèi)星引物,分別為Bp125、BcuB5.2、BcuF1.6、Bd47、Bcac5.10和Bcac6.12[3,7]。近幾年,應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記方法對(duì)柑橘小實(shí)蠅(B.dorsalis)、瓜實(shí)蠅(B.cucurbitae)、東澳番茄實(shí)蠅(B.cacuminata)、木瓜實(shí)蠅(B.papayae)和昆士蘭實(shí)蠅(B.tryoni)等果實(shí)蠅[8-14]種類(lèi)的種群遺傳多樣性已有較深入的研究,而對(duì)柑橘大實(shí)蠅種群間遺傳多樣性的研究國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。因此,本文運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記的方法,對(duì)中國(guó)大陸7省、市、自治區(qū)的18個(gè)不同地理種群間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析研究,以期為后續(xù)的柑橘大實(shí)蠅種群遺傳學(xué)、擴(kuò)散機(jī)理研究和制定防控措施等提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1樣本采集

于2010年-2012年5-6月柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)發(fā)生

期,分別在柑橘大實(shí)蠅主要發(fā)生為害的四川、重慶、陜西、貴州、湖南、湖北、廣西等 7省、市、自治區(qū)選取有代表性的18個(gè)地點(diǎn),使用蛋白餌劑和糖酒醋液對(duì)其成蟲(chóng)進(jìn)行誘捕,共采集到 478個(gè)個(gè)體。其中 7 個(gè)種群采自華中地區(qū),2 個(gè)種群采自華南地區(qū),剩余 9 個(gè)種群采自西部地區(qū)。其樣本的采集地、代碼、采集時(shí)間、樣本數(shù)等信息詳見(jiàn)表 1。

表1　柑橘大實(shí)蠅樣本采集信息1)Table 1　Information of Bactrocera minax samples

1) 18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群依據(jù)傳統(tǒng)地理區(qū)系劃分為華中、華南和中國(guó)西部3個(gè)組群,其中前7個(gè)種群為華中組群,FC和LZ為華南組群,其他為中國(guó)西部組群。

The 18B.minaxpopulations were divided into three groups, the central, southern and western China; the first 7 populations were the central China groups; FC and LZ were southern China groups, and others were western China groups.

1.2基因組DNA的提取

所收集到的478頭柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)個(gè)體均浸泡在95%乙醇中,于4℃冰箱保存,取其1/2胸部進(jìn)行DNA提取,提取過(guò)程按照TIANGEN公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)提取DNA的濃度,于-20℃冰箱中保存。

1.3引物的選擇及PCR反應(yīng)體系

微衛(wèi)星標(biāo)記選用的4對(duì)微衛(wèi)星引物引自高立志等發(fā)表的“柑橘大實(shí)蠅微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選”一文,分別為Bp125、BcuF1.6、Bcac5.10和 Bcac6.10等[3],每對(duì)引物的上游引物的5′端添加一種熒光標(biāo)記(依次為FAM、FAM、HEX和HEX),引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括10×PCR buffer 2.5 μL、 Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL、 dNTPs (10 mmol/L) 2 μL、上游引物(10 μmol/L) 分別為0.8、1.0 μL、 下游引物(10 μmol/L) 各 1.0 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL, Promega, USA) 0.4 μL和2 μL的模板 DNA,而后用ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min; 94℃ 45 s, 50～55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 進(jìn)行35個(gè)循環(huán);65℃ 30 min。12℃保存待用。后用毛細(xì)管電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,讀取峰值條帶大小,并根據(jù)前人研究的方法進(jìn)行基因分型,例如單倍型記作01、02、03等,雙倍體記作0101、0102、0203等[17-19]。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

使用軟件GeneMapper對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分型,根據(jù)不同軟件的要求記錄成不同的數(shù)據(jù)格式。而后用Popgene和Genpop軟件計(jì)算柑橘大實(shí)蠅種群的觀測(cè)等位基因數(shù)(allele number,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of allele,Ne)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、種群遺傳分化(the average of genetic differentiation,Fst)、遺傳距離(genetic distance)和哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)等,并依據(jù)種群間的遺傳距離,通過(guò) UPGMA 法來(lái)構(gòu)建18個(gè)柑橘大實(shí)蠅地理種群的聚類(lèi)圖進(jìn)行親緣關(guān)系分析[20-24]。

2　結(jié)果

2.1柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性

478個(gè)柑橘大實(shí)蠅個(gè)體在4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上平均擴(kuò)增成功率約為98%,共1 908個(gè)片段擴(kuò)增成功。每個(gè)種群的等位基因數(shù)19～30個(gè),平均為23.06個(gè),且4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上(Bp125、BcuF 1.6、Bcac 5.10和Bcac 6.10)的等位基因數(shù)分別為7、14、9、8個(gè)。其各個(gè)地理種群的有效等位基因數(shù)量與等位基因數(shù)量差異大致相當(dāng),變化范圍為7.253～16.050。在所有位點(diǎn)上的平均觀測(cè)雜合度為0.712 6,變化范圍為0.531～0.864;在所有位點(diǎn)上的平均期望雜合度為0.651,變化范圍為0.454～0.754,表明18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性都較高。對(duì)18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的哈迪—溫伯格平衡測(cè)試結(jié)果顯示,其卡方值的變化范圍為5.582～∞,各種群的差異性也大不相同(變化范圍為0.000～0.694),結(jié)果表明,在18個(gè)地理種群中只有十堰、秭歸、湘西、桃源和云陽(yáng)種群基本保持哈迪—溫伯格平衡,而其他種群則偏離平衡。具體擴(kuò)增結(jié)果等信息詳見(jiàn)表2。

表2　18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性1)Table 2　Genetic diversity of 18 Bactrocera minax populations based on four microsatellite loci

1) 自由度df=8.00。

Degree of freedomdf=8.00.

2.2群體間的遺傳固定系數(shù)分析

18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳距離是基于Nei’s法建立的,具體結(jié)果如表3所示。從表3中可以看出,18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群間的遺傳距離以富川與萬(wàn)州種群間的為最大(0.264),以秭歸與桃源種群間的為最小(0.004),其他種群的變化范圍在0.005～0.257之間,結(jié)果表明,18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群間存在較明顯的遺傳分化。同時(shí),我們對(duì)種群間的固定系數(shù)與地理距離的Mantel檢驗(yàn),其離散型的點(diǎn)狀分布表明(圖1),本研究涉及的18個(gè)柑橘大實(shí)蠅地理種群間的地理隔離現(xiàn)象并不明顯(決定系數(shù)R2=0.023)。

2.3種群間聚類(lèi)分析

在基于其微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集Nei’s 遺傳距離所構(gòu)建的鄰接樹(shù)(NJ)上,18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群被劃分為3個(gè)分支,詳見(jiàn)圖2。而且,在該進(jìn)化樹(shù)上的3分支與傳統(tǒng)地理區(qū)系的劃分情況是基本相一致的。同時(shí),為了檢測(cè) 3個(gè)分支在 18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的分布狀況,我們使用 Structure軟件的貝葉斯方法對(duì)其進(jìn)行集群分析,結(jié)果詳見(jiàn)圖3。其中,華南地區(qū)的富川和鹿寨種群主要被劃分在紅色集群,而中國(guó)西部地區(qū)的忠縣種群也主要在紅色集群,華中和中國(guó)西部種群則主要分散在藍(lán)色和綠色集群中。

圖1　柑橘大實(shí)蠅地理種群的遺傳距離與地理距離間的 相關(guān)性點(diǎn)狀分布圖(R2=0.023)Fig.1　Scatter plots of genetic distance vs. geographical distance for pairwise population comparisons (R2=0.023)

圖2　基于 18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集 構(gòu)建的鄰接樹(shù)(NJ)Fig.2　Neighbor-joining (NJ) tree of microsatellite data of the 18 sampled populations

圖3　由Structure軟件推斷的 18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群分化為 3大分支以及各個(gè)種群在這 3 大分支中的分布情況Fig.3　Proportion of membership coefficients of 18 Bactrocera minax populations into three inferred clusters obtained from Structure

種群Pop.SYZGYCJZXXTYLLFCLZQLGYWLZXWZYYWSHZJYSY—ZG0.008—YC0.1270.068—JZ0.2160.1740.146—XX0.1090.0920.0800.141—TY0.0050.0040.0900.1730.063—LL0.0190.0110.0580.1540.0740.014—FC0.2570.1840.1380.2400.1640.2080.178—LZ0.1910.1470.0970.1780.1000.1550.1150.038—QL0.0810.0610.0660.1130.0240.0410.0450.1680.119—GY0.1750.1190.0330.1730.1190.1380.1030.1710.1220.106—WL0.1270.0930.1010.0820.1320.0980.0860.2470.1860.0850.141—ZX0.1610.1370.1440.1730.0820.1310.1080.0770.0290.0940.1840.195—WZ0.1940.1460.1240.0220.1600.1550.1430.2640.2010.1170.1660.0550.208—YY0.1630.1100.0590.1640.0250.1050.1130.1780.1340.0500.1190.1350.1400.151—WS0.1710.1330.0880.0300.0400.1200.1160.1660.1160.0480.1180.0810.1130.0690.061—HZ0.0630.0340.0480.1180.0140.0260.0400.1540.1030.0190.0790.1010.0930.1170.0330.051—JY0.1100.0760.0850.1620.0300.0680.0850.1760.1280.0610.1370.1440.1090.1480.0220.0760.010—

3　討論

3.1高水平的遺傳多樣性

一般認(rèn)為,遺傳標(biāo)記在自然群體中表現(xiàn)的等位基因數(shù)量越多,研究位點(diǎn)的多態(tài)性也就越高,而當(dāng)選用標(biāo)記的位點(diǎn)等位基因數(shù)達(dá)到或超過(guò) 30 個(gè)時(shí),得到的遺傳信息較為可靠[24-26]。本研究選用 4 對(duì)多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物對(duì) 18 個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群進(jìn)行標(biāo)記分析,共檢測(cè)到 38 個(gè)等位基因,表明選用的這 4 對(duì)微衛(wèi)星引物可以較好地揭示柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性。

一個(gè)物種的遺傳資源表現(xiàn)為兩個(gè)基本水平:同一種群的不同個(gè)體間的遺傳分化和不同種群間的遺傳分化程度[27]。根據(jù)對(duì) 18 個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析,各個(gè)種群的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度都很高,而且,各個(gè)種群的等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)之間、觀測(cè)雜合度和期望雜合度之間的差異都相差不大,表明柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)大陸的遺傳多樣性較高。同時(shí),我們對(duì)18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的卡方檢測(cè)結(jié)果表明,在18個(gè)地理種群中只有十堰、秭歸、湘西、桃源和云陽(yáng)種群基本保持哈迪—溫伯格平衡,而其他種群則偏離平衡。分析其原因,我們認(rèn)為可能是由于某些等位基因的缺失或存在一些假等位基因所致。

3.2較弱的遺傳結(jié)構(gòu)

一般來(lái)說(shuō),遺傳距離能夠反映不同群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[28]。對(duì)18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳距離分析,結(jié)果表明18個(gè)不同種群間的遺傳距離都較大,即存在著較大的遺傳分化。同時(shí),我們對(duì)其遺傳距離和地理距離進(jìn)行的Mantal 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群間表現(xiàn)為離散型的點(diǎn)狀分布,說(shuō)明柑橘大實(shí)蠅種群在中國(guó)大陸的遺傳結(jié)構(gòu)較弱。而這正與遺傳多樣性高產(chǎn)生了矛盾,柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性高說(shuō)明其種群間的交流十分頻繁,而應(yīng)產(chǎn)生較強(qiáng)的遺傳結(jié)構(gòu),而本文亦證實(shí)柑橘大實(shí)蠅種群結(jié)構(gòu)弱,究其原因應(yīng)為柑橘大實(shí)蠅種群間的交流主要依靠地區(qū)間的柑橘貿(mào)易,而非本身的遷飛造成。

3.3聚類(lèi)分析

基于Nei’s遺傳距離,利用 UPGMA 法構(gòu)建柑橘大實(shí)蠅種群的個(gè)體聚類(lèi)圖,18個(gè)地理種群被分為三大類(lèi)群,其中,華中地區(qū)和中國(guó)西部地區(qū)的種群可基本區(qū)分開(kāi),但同一省份的種群卻很難完全聚在一起。對(duì)這18個(gè)不同地理種群進(jìn)行聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)這些種群也可被明顯劃分為華南、中國(guó)西部和華中三大組群,而這與傳統(tǒng)地理區(qū)系對(duì)這18個(gè)種群的劃分情況相一致。其中,中國(guó)西部地區(qū)的忠縣種群與華南組群聚為一類(lèi),我們推測(cè)其原因認(rèn)為是由于忠縣種群是由華南組群近期傳入所致。

4　結(jié)論

對(duì)18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析表明,中國(guó)柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性很高,且其18個(gè)不同地理種群間存在著較大的遺傳分化;同時(shí),我們對(duì)柑橘大實(shí)蠅種群的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析都將18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群劃分為3個(gè)分支,這與傳統(tǒng)地理區(qū)系劃分相一致。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Genetic diversity analysis ofBactroceraminax(Diptera: Tephritidae)in China

Gao Lizhi1,Liu Yinghong1,Wan Xuanwu2,Tu Zuxia3,Pu Po1,Chen Yuan1

(1.College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing400716, China; 2. Sichuan Plant Protection Station, Chengdu610041, China; 3. Chongqing Municipal Agricultural School, Chongqing401329, China)

We marked 18Bactroceraminaxgeographic populations from seven provinces in China with 4 microsatellite primers to analyze the genetic diversity of 18B.minaxgeographic populations. The numbers of alleles of the tested populations ranged from 19 to 30 (the mean was 23.06) and those for the 4 loci were 7, 14, 9, and 8, respectively. Meanwhile, the result of Hardy-Weinberg equilibrium test showed thatChi-squarevalues were significantly different among 18B.minaxpopulations, which ranged from 5.582 to infinity. The results suggested that the genetic diversity ofB.minaxpopulations was very high, so was the level of genetic differentiation between different populations.

Bactroceraminax;microsatellite marker;allele;genetic diversity

2014-11-21

2015-03-28

“973”計(jì)劃前期研究專(zhuān)項(xiàng)(2009CB125903)

E-mail: yhliu@swu.edu.cn

S 436.661.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.009