轉基因抗蟲耐除草劑復合性狀玉米‘雙抗12-5’對亞洲玉米螟的抗性及對草甘膦的耐受性研究

王　江,　武奉慈,　劉新穎,　馮樹丹*,　宋新元*

(1. 哈爾濱師范大學生命科學與技術學院, 哈爾濱　150025; 2. 吉林省農業科學院, 長春　130033)

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轉基因抗蟲耐除草劑復合性狀玉米‘雙抗12-5’對亞洲玉米螟的抗性及對草甘膦的耐受性研究

王江1,武奉慈2,劉新穎1,馮樹丹1*,宋新元2*

(1. 哈爾濱師范大學生命科學與技術學院, 哈爾濱150025; 2. 吉林省農業科學院, 長春130033)

通過田間接蟲、室內生測以及田間植株噴施草甘膦試驗,在吉林省公主嶺市綜合評價了轉cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑復合性狀玉米‘雙抗12-5’對亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]的抗性以及對草甘膦的耐受性,為‘雙抗12-5’在吉林省產業化應用提供基礎科學數據。結果表明,與非轉基因對照‘鄭單958’相比,‘雙抗12-5’全生育期對亞洲玉米螟都具有良好的抗性,達到高抗水平;取食‘雙抗12-5’心葉、雄穗及花絲等組織7 d后的亞洲玉米螟幼蟲存活率為4%～12%,而取食‘鄭單958’各個組織的亞洲玉米螟幼蟲存活率均高于96%。‘雙抗12-5’在噴施推薦劑量(1 230 g/hm2)及在2倍推薦劑量(2 460 g/hm2)草甘膦情況下,4周內均生長正常,受害率為0;對照‘鄭單958’植株第一周即表現出明顯的藥害癥狀,逐漸枯萎死亡,受害率達到100%。綜上所述,‘雙抗12-5’在吉林省表現出良好的抗蟲性和除草劑耐受性。

轉基因玉米;復合性狀;亞洲玉米螟;抗蟲性;除草劑耐受性

玉米是世界三大糧食作物之一,也是加工產業的主要原料,對保障農業產業結構穩定乃至糧食安全具有重要作用。亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]是危害我國玉米的主要害蟲,北方春玉米區因玉米螟為害,一般年份減產10%左右,大發生年份可導致玉米損失30%以上甚至絕產[1-2]。在玉米生育期施用化學藥劑防治玉米螟十分困難,并且對生態環境污染嚴重。農業生物技術的應用為食物短缺、環境污染等問題的解決帶來希望,其中轉基因玉米的研究與開發為防治病蟲害提供了新的途徑。研究表明,轉Bt基因抗蟲玉米對歐洲玉米螟[Ostrinianubilalis(Hübner)]和亞洲玉米螟[O.furnacalis(Guenée)]等鱗翅目害蟲具有良好的防治效果[3-6]。我國轉基因玉米研發始于20世紀80年代末期,現已創造出一批優異的轉基因玉米材料,為產業化實施奠定了一定的基礎[7]。

功能效率有效性是應用轉基因植物的根本所在,常雪等報道了6個轉cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps玉米品系對亞洲玉米螟的殺蟲效果,為亞洲玉米螟的有效防治提供技術儲備[8]。后續,浙江大學研發團隊通過傳統育種方法,聚合耐除草劑性狀,創制出兼抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj與耐除草劑基因G10evo-epsps的轉基因玉米新品系‘雙抗12-5’。其中,選用的cry1Ab與cry2Aj是目前研發多基因抗蟲作物常用的基因,對亞洲玉米螟有較高的殺蟲活性[9-13],同時新聚合的草甘膦靶標酶EPSPS基因G10,對草甘膦具有很高的耐受性[14]。

在轉基因玉米新種質創制過程中每代均需目標性狀鑒定篩選,是其商業化種植前必須完成的工作[15]。本試驗在吉林省春玉米區對轉基因抗蟲耐除草劑復合性狀玉米‘雙抗12-5’進行田間抗螟性鑒定和室內殺蟲生測試驗;同時進行了田間噴施高劑量目標除草劑(草甘膦)試驗,為轉基因玉米‘雙抗12-5’的產業化推廣提供基礎安全數據。旨在培育出我國自主研制的、研發階段最靠前的抗蟲耐除草劑復合性狀玉米新品系。

1　材料與方法

1.1供試玉米

轉cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑復合性狀玉米‘雙抗12-5’(為雜交種)及非轉基因對照‘鄭單958’,均由浙江大學提供。

1.2供試昆蟲與除草劑

供試昆蟲:亞洲玉米螟來自“國家轉基因玉米大豆中試與產業化基地(公主嶺)”室內人工飼料飼養種群,原始種群采自吉林省公主嶺市。田間抗蟲性鑒定選用即將孵化的“黑頭卵”,室內生測試驗選用初孵幼蟲。

供試除草劑:41%草甘膦異丙胺鹽(glyphosate isopropylamine salt)水劑,美國孟山都公司。

1.3試驗地點

試驗于2014年在“國家轉基因玉米大豆中試與產業化基地(公主嶺)”環境安全研究試驗圃場完成。

1.4田間抗螟性鑒定

種植方式:參考當地玉米大田生產方式,隨機區組設計,每個品種3次重復,小區面積為30 m2(5 m×6 m),行距60 cm,株距25 cm,試驗小區間設2 m的過道間隔,避免害蟲在不同小區之間的擴散。常規播種方式,常規栽培管理,全生育期不噴施殺蟲劑。

心葉期抗螟性評價:在玉米心葉期(玉米植株6葉至8葉),玉米螟卵發育至“黑頭卵”階段,在玉米心葉中放置即將孵化黑頭卵的蠟紙片2塊(約60粒卵),每小區接蟲45株。接蟲14 d后,逐株調查接蟲株中上部葉片被玉米螟危害程度,包括受害葉片上的蟲孔大小、數量及分布等。食葉級別劃分標準采用目前通用的國際玉米螟協作組制定的9級分級標準[16]。根據各株玉米的玉米螟食葉級別計算各小區心葉期玉米螟對葉片食葉級別的平均值,按食葉級別平均值劃分玉米對玉米螟的抗性類型。

吐絲期抗螟性評價:玉米生長至吐絲期(雌穗露出花絲),在玉米花絲頂部放置即將孵化黑頭卵的蠟紙片2塊(約60粒卵),每小區接蟲45株。接蟲后于收獲前逐株調查接蟲玉米雌穗受害情況(包括花絲被害情況、穗尖被害情況、存活幼蟲齡期、蛀孔隧道長度)、莖稈受害情況(包括單株蛀孔數、單株活蟲數、單株隧道個數、單株隧道長度)。根據各株玉米的雌穗危害級別計算玉米螟對玉米雌穗危害級別的平均值,雌穗被害級別平均值=∑(危害級別×該級別植株數)/調查總株數。雌穗危害級別采用農業部953號公告-10.1-2007的9級分級標準[17]。按雌穗危害級別平均值劃分各品種對亞洲玉米螟的抗性類型,劃分依據采用農業部953號公告-10.1-2007的5級分級標準。

1.5室內抗螟性鑒定

在室內可控條件下對亞洲玉米螟的抗性進行嚴格鑒定,分別選取田間玉米心葉期的心葉、抽雄期的雄穗、吐絲期的花絲、灌漿期的雌穗穗尖、蠟熟期的籽粒。將不同組織清洗干凈后分別置于12孔培養板中,每孔放適量玉米組織,單頭飼養亞洲玉米螟初孵幼蟲,利用10孔(飼養10頭幼蟲)作為一個處理,每個處理5次重復,即每個組織測試50頭幼蟲。置于溫度28℃,RH 80%,光照周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱內飼養,期間根據各組織被取食消耗情況隨時添加相同來源的新組織。從接蟲第2天開始每2 d調查1次幼蟲存活狀況,記錄存活幼蟲數,調查4次。

1.6除草劑耐受性鑒定

試驗種植方式參考當地玉米大田生產方式,分區設計,小區面積不小于24 m2(6 m×4 m),3次重復,隨機區組排列。

處理包括:轉基因玉米噴施清水;轉基因玉米噴施目標除草劑;非轉基因對照噴施清水;非轉基因對照噴施目標除草劑。

所用除草劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑,施用劑量分別為農藥登記標簽的推薦劑量(1 230 g/hm2)和推薦劑量2倍量(2 460 g/hm2)。在玉米植株生長至6葉期噴施除草劑。各小區中間兩行為調查行。分別在用藥后1周、2周和4周調查記錄成苗率、植株高度(選取最高的5株)、藥害癥狀(選取藥害癥狀最輕的5株)。藥害癥狀分級按GB/T19780.42執行。各小區草甘膦除草劑受害率計算公式:

其中:X為草甘膦處理受害率(%)；N為同一受害級別的植株數;S為危害級別;T為調查植株總數M為試驗觀測到的最高危害級別。

1.7數據統計分析處理

對亞洲玉米螟幼蟲存活率的影響、食葉級別、玉米莖稈蟲孔數、隧道長度和活蟲數等數據采用DPS數據處理系統進行單因素方差分析,處理間采用新復極差法進行差異顯著性分析。

2　結果與分析

2.1轉基因玉米心葉期田間抗螟性

心葉期接蟲試驗結果顯示,轉基因玉米‘雙抗12-5’只有極少數針刺狀危害,食葉級別平均值為1級,抗性類型為高抗;非轉基因對照‘鄭單958’葉片有較多排孔和長條孔,心葉期食葉級別平均值為7級,抗性類型為感。表明轉基因玉米‘雙抗12-5’心葉期對亞洲玉米螟具有良好的防治作用。

2.2轉基因玉米吐絲期田間抗螟性

吐絲期接蟲試驗中,調查接蟲植株雌穗受害情況與莖稈受害情況。雌穗受害情況調查中,以花絲被害情況、雌穗穗尖被害情況、存活幼蟲齡期、蛀孔隧道長度為評價參數,依據農業部953號公告-10.1-2007的9級分級標準[17],結果表明,轉基因玉米‘雙抗12-5’的雌穗被害級別平均值為1.0,抗性類型為高抗;其對應的非轉基因對照‘鄭單958’的雌穗被害級別平均值為5.7,抗性類型為感(表1)。莖稈受害情況調查中,以單株蛀孔數、單株活蟲數、單株隧道個數和單株隧道長度作為評價參數,結果表明,轉基因玉米‘雙抗12-5’的莖稈未受亞洲玉米螟危害,而非轉基因對照‘鄭單958’莖稈受害嚴重,兩者間差異顯著(表2)。綜合雌穗受害情況與莖稈受害情況,轉基因玉米‘雙抗12-5’對亞洲玉米螟抗性顯著高于對照‘鄭單958’,并且達到高抗水平,在吐絲期對亞洲玉米螟具有良好的抗蟲效果。

表1　吐絲期田間接蟲試驗玉米雌穗被害級別及抗蟲性水平Table 1　Damage ratings and resistant levels of maize ear under artificial infestation with Ostrinia furnacalisat silking stage in the field

表2　吐絲期田間接蟲試驗玉米莖稈受害情況調查結果1)Table 2　Survey result of maize stalk under artificial infestation with Ostrinia furnacalis at silking stage in the field

1) 表中數據為平均值±標準誤,同列數據后不同字母表示經SSR測驗差異顯著(P<0.05)。
The data in the table are mean±SE. Data in the same column followed by different letters are significantly different (P<0.05) according to SSR test.

2.3室內抗螟性鑒定

室內生測試驗結果表明,亞洲玉米螟取食轉基因玉米‘雙抗12-5’心葉、雄穗、花絲、雌穗穗尖和籽粒1、3、5和7 d后的存活率呈明顯的下降趨勢;取食非轉基因對照‘鄭單958’相應組織的處理,亞洲玉米螟存活率變化不大。取食轉基因玉米‘雙抗12-5’3、5和7 d后,亞洲玉米螟的存活率均低于取食‘鄭單958’,且達到顯著水平。取食‘雙抗12-5’不同組織第7天時,亞洲玉米螟存活率均較低,為4%～12%;而取食非轉基因對照玉米‘鄭單958’相應組織的亞洲玉米螟存活率都達到96%(表3)。結果表明,轉基因玉米‘雙抗12-5’對亞洲玉米螟抗性顯著高于對照‘鄭單958’。

表3　不同組織對亞洲玉米螟幼蟲的殺蟲效果1)Table 3　Efficacy of different tissues against the Ostrinia furnacalis neonates

1) 表中數據為平均數±標準誤,同行成對數據后不同字母表示經SSR測驗差異顯著(P<0.05)。
Data in the table are mean ± SE, within a line followed by different letters were significantly difference (P<0.05) according to SSR test.

2.4轉基因玉米田間除草劑耐受性

在噴施推薦劑量和2倍推薦劑量草甘膦處理中,噴施1、2、4周后,‘雙抗12-5’生長正常,受害率為0;

‘鄭單958’顯示出明顯的藥害癥狀,出現停止生長、葉片枯萎發黃等癥狀,受害率達到100%(圖1)。

圖1　噴施2倍推薦劑量草甘膦的兩個玉米品種田間表現Fig.1　Field symptom of ‘Shuangkang 12-5’ and ‘Zhengdan 958’after application of glyphosate at double dose level

在噴施清水、推薦劑量草甘膦、2倍推薦劑量草甘膦的3個處理中,轉基因玉米‘雙抗12-5’株高基本一致,無顯著差異;對應的非轉基因對照‘鄭單958’在噴施草甘膦與清水處理間的株高差異極顯著(表4)。結果表明,非轉基因對照‘鄭單958’對草甘膦敏感,無耐受性,轉基因玉米‘雙抗12-5’對草甘膦具有明顯的耐受性,并且噴施草甘膦對其植株生長發育無明顯影響。

表4　轉基因玉米對除草劑草甘膦的耐受性鑒定1)Table 4　Tolerance identification of the transgenic maize to glyphosate

1) 表中數據為平均數±標準誤,同列數據后不同字母表示經SSR測驗差異顯著(P<0.05),“—”表示未進行檢測。

The data in the table are mean±SE. Data in the same column followed by different letters are significantly different (P<0.05) according to SSR test. The symbol “—” indicated no data.

3　討論

目標性狀有效性是應用轉基因植物的根本所在,針對抗蟲轉基因玉米,一般采用田間人工接蟲鑒定與室內生測相結合的方法。例如美國孟山都公司研發的第1代轉Bt基因玉米轉化事件MON810的田間抗蟲性評價結果表明,表達的Cry1Ab 蛋白對歐洲玉米螟和亞洲玉米螟具有很好的抗蟲性,能高效控制玉米螟心葉期和穗期世代為害[18];王月琴等采用田間接蟲與室內生測相結合的方法研究了轉基因玉米‘BT799’對亞洲玉米螟的抗性,室內生測結果表明玉米‘BT799’對亞洲玉米螟具有較高的殺蟲效果,田間接蟲結果表明轉基因玉米整個生育期對亞洲玉米螟都有較高的抗性[19],此試驗結果與武奉慈等利用田間接蟲法研究轉基因玉米‘BT799’對亞洲玉米螟抗性的結果相一致[20]。針對耐除草劑轉基因玉米,一般采用田間植株噴施目標除草劑的方法,例如Heck等將雙價CP4-epsps轉入玉米,通過在玉米植株三葉期和六葉期噴灑3.36 kg酸當量/hm2草甘膦的方法來篩選高抗株系,得到了可抗4倍于生產劑量草甘膦的轉基因玉米[21]。針對多種復合性狀轉基因玉米,一般綜合采用各個單一目標性狀有效性的鑒定方法,例如孫越對轉cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS基因復合性狀玉米種質的目標性狀進行鑒定,綜合研究結果表明其抗蟲性、抗草甘膦除草劑性和抗旱性效果都達到相應的標準,選育出具有優良復合性狀并能穩定遺傳的轉基因玉米新種質[22]。同時,鑒于轉基因玉米功能效率的發揮可能受推廣地區環境的影響[23],本試驗選址轉基因玉米‘雙抗12-5’擬推廣的地區吉林省,綜合利用田間人工接蟲鑒定與室內生測相結合的方法研究其亞洲玉米螟抗性,利用田間噴施目標除草劑方法研究其草甘膦耐受性,研究結果表明轉基因玉米‘雙抗12-5’在吉林地區田間條件下,抗蟲性與除草劑耐受性高效,表現出良好的功能效率,具有潛在的推廣前景。

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(責任編輯：楊明麗)

Evaluation of transgenic maize‘Shuangkang 12-5’with complex traits of insect-resistance and glyphosate-resistance for the resistance toOstriniafurnacalisand tolerance to glyphosate

Wang Jiang1,Wu Fengci2,Liu Xinying1,Feng Shudan1,Song Xinyuan2

(1. College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin150025, China;2. Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun130033, China)

‘Shuangkang 12-5’ is a maize variety harbored the genescry1Ab/cry2AjandG10evo-epsps. Evaluation of the transgenic maize for the resistance to Asian corn borer [Ostriniafurnacalis(Guenée)] and tolerance to glyphosate was assayed in Gongzhuling City, Jilin Province. Field and indoor bioassay demonstrated that the ‘Shuangkang 12-5’ exhibited a high resistance to Asian corn borer during the whole growth period, compared with non-transgenic variety ‘Zhengdan 958’. The survival rate of the larvae that fed on different tissues of ‘Shuangkang 12-5’ for 7 days were 4%-12%, while that fed on non-transgenic lines were above 96%. When treated with glyphosate at the recommended dose (1 230 g/hm2)and the double dose (2 460 g/hm2), all the transgenic lines survived in four weeks, but there was symptom of serious chemical damage in one week and the plant gradually died for the non-transgenic lines. Thus, the transgenic maize ‘Shuangkang 12-5’presented good insect resistance and herbicide tolerance in Jilin Province.

transgenic maize;complex traits;Ostriniafurnacalis;insect resistance;herbicide tolerance

2015-08-13

2015-10-15

國家自然科學基金(31301329)；轉基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08011-003)；黑龍江省自然科學基金(c201307)

馮樹丹E-mail:sdf6616@163.com；宋新元E-mail：songxinyuan1980@163.com

S 435.13

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.008