葡萄霜霉菌候選效應子RXLR5信號肽的鑒定

孔祥久,　石　潔,　孔繁芳,　王忠躍,　張　昊

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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葡萄霜霉菌候選效應子RXLR5信號肽的鑒定

孔祥久,石潔,孔繁芳,王忠躍*,張昊*

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

利用Getorf、 SignalP 3.0、BLASTP等生物信息學軟件和PERL語言從葡萄霜霉菌基因組中預測到一條編碼RXLR-EER結構域的效應蛋白候選基因,將該基因編碼的蛋白命名為RXLR5。將RXLR5信號肽SP5編碼序列連接到pSUC2T7M13ORI載體并轉化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12后,重組菌株能成功分泌蔗糖酶,促使棉籽糖分解成單糖,因此,能在YPRAA培養基上正常生長;同時生成的單糖能與TTC反應產生紅色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。由此推測,SP5具有信號肽活性,可能在RXLR5從葡萄霜霉菌細胞內泌到胞外的過程中起重要作用。

葡萄霜霉病菌;信號肽;酵母分泌系統;蔗糖酶活性

葡萄霜霉病是影響全球葡萄產業發展的第一大病害。葡萄霜霉菌[Plasmoparaviticola(Berk.etCurt.) Berl.etde Toni]是葡萄霜霉病的病原菌,屬于鞭毛菌亞門、卵菌綱、霜霉目、霜霉科、單軸霉屬,是一種專性寄生卵菌,該病原菌可以侵染葡萄的任何綠色部分或組織,從而造成果實產量下降、品質降低等現象[1]。葡萄霜霉病造成的損失巨大,流行年份可高達20%～80%[2-3],嚴重時幾乎顆粒無收[4-5]。探索葡萄霜霉病菌與葡萄的互作關系,可以為葡萄霜霉病防控提供其他可行途徑。

植物病原真菌或卵菌在與寄主植物相互作用時分泌多種不同的效應蛋白進入寄主植物細胞間或細胞內,通過抑制寄主的防御反應促使自身在寄主植物上定殖、生長和發育[7-8]。植物病原卵菌編碼一大類被稱為 RXLR(Arg-X-Leu-Arg)的效應蛋白,這類效應蛋白的N端1～30個氨基酸處含有一段信號肽序列,負責效應蛋白的泌出,在30～60個氨基酸處含有保守的 RXLR-dEER 結構域,負責效應蛋白進入寄主植物組織,因此將其稱為 RXLR 效應蛋白[9]。目前,已有多個卵菌的無毒基因被克隆并鑒定,如大豆疫霉(Phytophthorasojae)效應蛋白 Avr1a[10]、 Avr1b[11]、Avr1c[10]和Avr1d[12];致病疫霉(Phytophthorainfestans)效應蛋白Avr3a[13];擬南芥霜霉(Hyaloperonosporaparasitica)效應蛋白ATR1[14]和 ATR13[15];黃瓜霜霉(Pseudoperonosporacubensis)效應蛋白PcQNE[16]等,但是,目前葡萄霜霉菌的致病機理相關報道還很少,其與葡萄之間的相互識別機制也并不明確。本研究旨在將植物病原卵菌效應蛋白信號肽預測和鑒定方法用于葡萄霜霉菌效應蛋白信號肽的預測和鑒定,并證實該方法是否可行,從分子水平加深對葡萄霜霉菌-葡萄互作的認識,為新防治策略的研發及抗病葡萄新品種的培育提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1病原體的分離、接種、擴繁

供試葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)采自河北廊坊中國農業科學院廊坊科研中試基地‘紅地球’葡萄品種。發病葉片在潮濕的容器中過夜培養,然后用無菌水洗脫收集孢子囊。將孢子囊懸浮液涂到3%水瓊脂培養基上,在顯微鏡下將含單孢子囊的瓊脂塊倒扣在葉盤上促使侵染。供試葡萄品種為‘里扎馬特’,生長條件為25℃,L∥D=16 h∥8 h。接種5～7 d后,從單孢子囊侵染的葉片組織收集孢子囊配成懸浮液(105孢子囊/mL)進行后續接種擴繁。接種的葉盤先在21℃、相對濕度約100%的黑暗條件下處理24 h,再將其置于21℃、相對濕度約100%、L∥D=16 h∥8 h的光照培養箱中培養。

1.2可能的RXLR效應蛋白的預測

根據葡萄霜霉菌基因組信息,利用生物信息學軟件EMBOSS(6.4.0.0)軟件包中的Getorf軟件分析可能的開放閱讀框(ORF);用SignalP 3.0軟件預測信號肽,采用隱馬爾可夫模型,要求信號肽的可能性≥0.9,信號肽的最大剪切位點位于10～30個氨基酸處;用PERL語言編程分析序列中30～60個氨基酸處是否含有RXLR序列,RXLR序列下游是否含EER序列[17]。按照上述步驟找到了一條可能的編碼RXLR-EER效應蛋白的基因,將該基因編碼的蛋白命名為RXLR5。

1.3葡萄霜霉菌基因組DNA的提取及RXLR5基因的克隆

PCR反應體系(20 μL):基因組DNA模板1 μL,10 μmol/L引物R5F和R5R各1 μL,2×Premix PrimeSTAR HS Mix 10 μL,滅菌ddH2O 7 μL。

PCR反應程序:95℃預變性5 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min 50 s,35個循環;最后72℃延伸10 min。

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,采用ExnaseTMⅡ重組酶(Vazyme, USA)與CE Entry Vector連接,并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,陽性菌落采用通用引物M13-47/M13-48進行PCR鑒定,最后將篩選得到的重組質粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4pSUC2T7M13ORI-SP5重組質粒的構建及酵母轉化

PCR反應體系(20 μL):基因組DNA模板1 μL,10 μmol/L的引物各1 μL,2×Premix PrimeSTAR HS Mix10 μL,滅菌ddH2O 7 μL。

PCR反應程序:95℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸15 s,35個循環;最后72℃延伸10 min。

采用Frozen-EZ Yeast Transformation II kitTM(Zymo Research, Orange, CA, U.S.A.)將構建好的載體pSUC2-SP5、陰性對照載體pSUC2-Mg87[19]、陽性對照載體pSUC2-Avr1b[20]分別轉化到SUC2缺乏的酵母菌株 YTK12中。在CMD-W 培養基(0.67%不含氨基酸的酵母氮源、 0.075% tryptophan dropout supplement、2%蔗糖、0.1% 葡萄糖和2% 瓊脂[18])上培養2～4 d來篩選轉化子。

圖1　酵母信號序列誘捕載體pSUC2T7M13ORI[18]Fig.1　The yeast signal sequence trap vector, pSUC2T7M13ORI

1.5對二糖利用能力鑒定

將轉化子畫線到含棉籽糖的YPRAA培養基(1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 棉籽糖、2 μg/L

的抗霉素A、2% 瓊脂)上,通過觀察酵母菌對棉籽糖的利用情況來驗證SP5的功能。同時將轉化子畫線到YPDA(1%酵母、2%蛋白胨、 2% 葡萄糖、0.003%硫酸腺嘌呤和2%瓊脂[18])和CMD-W培養基作為對照。

1.6TTC顯色鑒定

按Oh等[21]的方法,用TTC檢測分泌的蔗糖酶的活性。具體步驟如下,在含5 mL CMD-W 液體培養基的離心管中接種轉化的酵母菌株pSUC2-SP5、pSUC2-Mg87、pSUC2-Avr1b,在YPDA培養基上接種YTK12對照菌株,250 r/min 30℃搖菌24 h,13 000 r/min離心5 min來收集沉淀。用無菌超純水洗沉淀兩次,并重懸于5 mL無菌水中;取1 mL菌液測A600值,稀釋使其A600=0.6,取1 mL稀釋液于含5 mL蔗糖溶液的15 mL離心管中,顛倒混勻;加入1%TTC溶液35℃水浴35 min,室溫放置5 min。陽性反應會由無色變為深紅色。

2　結果與分析

2.1RXLR5蛋白序列基本信息

RXLR5的基因由1 878個堿基組成,編碼含625個氨基酸的蛋白質,用SignalP 3.0 預測在N端1～21個氨基酸為信號肽(以黑色框標出,圖2)的可能性為0.933(圖3);RXLR位于50～53個氨基酸處(以藍色框標出,圖2);EER位于69～71個氨基酸處(以紅色框標出,圖2)。

圖2　RXLR5蛋白序列基本信息Fig.2　The basic information of the RXLR5 protein sequence

圖3　SignalP-HMM 預測模型Fig.3　SignalP-HMM prediction model

2.2RXLR5基因的擴增

圖4顯示,引物R5F/R5R擴增RXLR5基因的大小為1 878 bp。

圖4　RXLR5基因擴增產物Fig.4　The PCR product of RXLR5 gene

2.3對二糖利用能力的鑒定

攜帶pSUC2-SP5和pSUC2-Avr1b的酵母菌株YTK12,能在以棉籽糖為唯一碳源的YPRAA培養基上生長(如圖5),說明SP5與Avr1b具有同樣的信號肽活性,與SUC2融合后能夠使蔗糖酶正常分泌到胞外,從而將棉籽糖分解為酵母可直接利用的單糖。陰性對照pSUC2-Mg87不具備信號肽活性,與缺陷型菌株YTK12一樣不能將合成的蔗糖酶分泌到胞外,因此不能在YPRAA培養基上生長。同時含有轉化子的酵母菌在YPAD和 CMD-W培養基上的生長情況作為對照。

圖5　YPRAA、YPAD和CMD-W培養基上的酵母生長試驗Fig.5 Yeast growth assay on media with YPRAA, YPAD or CMD-W

2.4TTC顯色鑒定

由圖6可知,攜帶pSUC2-SP5和pSUC2-Avr1b的酵母菌株YTK12分泌蔗糖酶能把蔗糖水解成單糖,單糖與TTC反應產生紅色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。YTK12和攜帶pSUC2-Mg87的酵母菌株YTK12不分泌蔗糖酶,因此不能與TTC發生顯色反應。

圖6　分泌的蔗糖酶與TTC的顯色反應Fig.6　The color reaction of invertase secreted by transformants with TTC

3　討論

植物與病原菌在長期進化過程中,進化出了一系列侵染與防御機制。一方面,寄主通過物理防御、抗菌化合物、先天免疫等獨特的機制阻止病原菌侵染。另一方面,植物病原菌也通過分泌大量的效應分子,抑制寄主防御系統,從而幫助自身完成侵染[22]。因此,效應子直接影響植物與病原物之間的相互識別。明確效應子功能對于解析植物與病原物之間的互作機制具有十分重要的意義。

鑒定效應子首先要確定其是否能夠分泌到細胞外。本研究通過生物信息學分析預測到一條具有RXLR-EER保守序列的候選效應蛋白,并具在N端含有可能的信號肽序列。利用酵母分泌系統通過蔗糖酶活性檢測等試驗證實了其信號肽序列能夠使缺陷型酵母重新分泌蔗糖酶,使其能在YPRAA培養基正常生長,并使TTC顯色,說明SP5具有信號肽活性。這些結果表明將植物病原真菌和卵菌效應蛋白信號肽預測和鑒定方法用于葡萄霜霉菌效應蛋白信號肽的預測和鑒定是可行的,這為葡萄霜霉菌RXLR效應蛋白的鑒定奠定了良好基礎,對于推動認識葡萄-葡萄霜霉病菌互作的分子機制,建立葡萄霜霉病的新型防控途徑具有重要的理論意義。

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(責任編輯：田喆)

Identification of the signal peptide of candidate effector protein RXLR5 fromPlasmoparaviticola

Kong Xiangjiu,Shi Jie,Kong Fanfang,Wang Zhongyue,Zhang Hao

(State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

By using bioinformatics approaches, we identified an RXLR-EER effector fromPlasmoparaviticolagenome, RXLR5. We used the predicted signal peptide SP5 in-frame with the mature sequence of yeast invertase SUC2 in the yeast signal sequence trap vector pSUC2T7M13ORI, and the resultant construct was transferred into a yeast SUC2-minus strain. The fusion of SP5 to the SUC2 mature sequence enabled the successful secretion of invertase, thus enabling the yeast cells to hydrolyze raffinose and grow on YPRAA medium. The secretion of invertase and the hydrolysis of raffinose into monosaccharides were also confirmed with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC), which reacts with monosaccharides to form the insoluble triphenylformazan (red color). These results suggest that SP5 might have a signal peptide activity, and play an important role in the secretion of RXLR5 out of the cell.

Plasmoparaviticola;signal peptide;yeast secretion system;invertase activity

2014-12-23

2015-04-07

公益性行業(農業)科研專項(201203035);國家現代農業產業技術體系專項資金(nycytx-30)

E-mail:wangzhongy0301@sina.com;hzhang@ippcaas.cn

S 436.631.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.007