黑龍江省部分地區馬鈴薯瘡痂病菌種類及致病性鑒定

邢瑩瑩,　呂典秋,　魏　琪,　萬書明,　董學志,　邱彩玲,　金光輝*

(1. 黑龍江八一農墾大學農學院, 大慶　163319; 2. 黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所, 哈爾濱　150086)

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黑龍江省部分地區馬鈴薯瘡痂病菌種類及致病性鑒定

邢瑩瑩1,呂典秋2,魏琪2,萬書明2,董學志2,邱彩玲2,金光輝1*

(1. 黑龍江八一農墾大學農學院, 大慶163319; 2. 黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所, 哈爾濱150086)

為明確黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌的種類及其特征,2012-2013年從黑龍江省克山縣、綏化市、哈爾濱市、杜爾伯特蒙古族自治縣采集具有瘡痂病病斑的馬鈴薯塊莖,從中分離純化病原菌,根據16S rRNA基因的差異采用分子手段對所分離的菌株進行種類和致病性鑒定,并對txtAB陽性菌株采用蘿卜幼苗法或馬鈴薯致病性試驗測定其致病性。共分離出74株菌株,鑒定出致病性菌株26株,其中Streptomycesscabies或S.europaeiscabiei21株,S.turgidiscabies3株和S.acidiscabies2株。所有的致病性菌株中共有4種致病島基因型,即nec1+/tomA+、nec1-/tomA+、nec1+/tomA-和nec1-/tomA。

馬鈴薯瘡痂病;Streptomycesspp.;致病島基因型

馬鈴薯是世界第四大作物,隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴大,一些馬鈴薯次生病害的危害逐漸凸顯,馬鈴薯瘡痂病就是其中之一[1],其在世界各國馬鈴薯生產區均有發生[2],在美國該病被認為是馬鈴薯生產中的第四大病害[3]。黑龍江省是我國重要的商品薯和種薯生產基地,各產區瘡痂病的發生率和嚴重程度呈逐年上升的趨勢，嚴重影響馬鈴薯塊莖的外觀品質。瘡痂病菌除侵染馬鈴薯外,還可以在甜菜、胡蘿卜、防風草、蕪菁、蘿卜等多種作物上引起不同程度的瘡痂病癥狀[4]。

馬鈴薯瘡痂病由土壤中習居的多種鏈霉菌引起,Streptomycesscabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies被認為是引起馬鈴薯瘡痂病的最普遍的病原菌,除此之外,已報道的其他致病性鏈霉菌多達十幾種[5-6],甚至可能更多。2000年以來仍不斷有新致病菌種類被報道[7-9], 由此可見,馬鈴薯瘡痂病的病原非常復雜,由于氣候和環境條件的差異,不同地區或同一地區不同季節流行不同的病原鏈霉菌[10]。因此,明確特定地區病原菌的構成對了解及防治瘡痂病十分重要。

txtAB、txtC、nec1和tomA等[11]致病性基因和毒力基因聚集在可移動的致病島(pathogenicity island 即PAI)中[12],其中txtAB是控制毒素合成的基因,是菌株是否具有致病性的決定性因子,nec1和tomA基因只與菌株的毒力相關[13]。研究表明PAI可以從致病性鏈霉菌中轉移到腐生型菌株中,從而產生新的致病性菌株[14]。本研究從黑龍江省各地采集的瘡痂病樣品中分離鏈霉菌,明確了黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌的PAI基因型和主要種類,以期為瘡痂病的防治和抗瘡痂病育種奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1病樣的采集

2012-2013年從黑龍江省克山縣、綏化市、哈爾濱市、杜爾伯特蒙古族自治縣(以下簡稱為杜蒙)4個馬鈴薯產區采集瘡痂病塊莖樣品68個,記錄病樣的采集地、品種及病斑類型。

1.2菌株的分離、純化

將塊莖用自來水洗凈,自然晾干后浸于70%乙醇中20 s表面消毒,再用無菌蒸餾水浸洗2～3次。參考Dees等[15]和Leiminger等[16]的分離方法在無菌條件下進行病原菌的分離,28℃條件下暗培養7～15 d后,挑取不同特征的菌落于酵母麥芽精瓊脂培養基(YME)中畫線純化2～3次。

1.3DNA的提取

刮取適量菌落菌絲于1.5 mL離心管中。采用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的G+細菌基因組DNA小量提取試劑盒提取DNA。加入溶菌酶后水浴1 h,其他操作步驟按照說明書進行。提取的DNA溶于TE緩沖液后貯藏在-20℃冰箱中待用。

1.4PCR鑒定致病性鏈霉菌

將所有分離純化后的菌株首先用鏈霉菌屬16S rRNA基因通用引物PA-PH進行PCR擴增反應,鑒定菌株是否為鏈霉菌。引物序列:PAF:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,PHR:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA[17]。反應體系:10×PCR buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL, PAF: 0.5 μL, PHR: 0.5 μL, LATaq0.15 μL,模板 1 μL。擴增條件同Edwards的方法[17]。擴增產物以1%瓊脂糖凝膠于1×TAE電泳緩沖液中,于150 V電壓,200 mA電流下電泳20 min,用紫外凝膠成像系統觀察結果,并拍照記錄。鑒定為鏈霉菌屬的菌株采用引物TxtAB1和TxtAB2進行PCR擴增,區分成致病性菌株和非致病性菌株兩大類,其中致病性菌株用于病原菌種類鑒定。引物序列:TxtAB1:5′-CCACCAGGACCTGCTCTTC-3′,TxtAB2:5′-TCGAGTGGACCTCACAGATG-3′。擴增條件同Wanner的方法[18]。反應體系及電泳檢測同上,本研究中所有PCR反應均重復3次。

1.5病原菌種類鑒定

1.5.1PCR鑒定致病菌種類

本研究采用根據16S rRNA基因設計的6對特異性引物(表1)分別鑒定S.scabies或S.europaeiscabiei、S.turgidiscabies、S.aureofaciens、S.acidiscabies、S.bottropensis、S.stelliscabiei。種類鑒定所用引物及擴增條件見表1。反應體系及電泳檢測同1.4,所有PCR反應均重復3次。因S.scabies和S.europaeiscabiei的序列僅有幾個堿基的差別,16S rRNA基因擴增無法區分這兩個種,因此ScabF-ScabR引物PCR擴增呈陽性的菌株只能判定為S.scabie/S.europaeiscabiei[15]。

表1　致病菌種類鑒定所用引物列表Table 1　Primers used for species detection by PCR

續表1Table 1(Continued)

病原Pathogen引物名稱及序列(5'→3')Primernameandsequence(5'→3')目的片段大小/bpProductsize變性溫度及時間Denaturationtemperatureandtime退火溫度及時間Annealingtemperatureandtime延伸溫度及時間Extensiontemperatureandtime參考文獻ReferenceS.bottropensisStelF:GAAAGCATCAGAGATGGTGCCAciR:CGACAGCTCCCTCCCACAAG47595℃40s60℃40s72℃100s[18]S.stelliscabieiStelF:GAAAGCATCAGAGATGGTGCCStelR:CGACAGCTCCCTCCCCGTAAG47695℃40s60℃40s72℃100s[18]

1.5.216S rDNA序列分析

選取1.5.1中未鑒定出種類的菌株和部分鑒定出種類的菌株以鏈霉屬通用引物PAF-PAH進行PCR擴增,擴增條件同1.4。將PCR擴增產物送上海生物工程技術服務有限公司測序,得到的16S rRNA序列在GenBank中進行BLAST比對,利用MEGA 6.0軟件進行多重序列比對,并構建系統發育樹。

1.6PAI基因的PCR檢測

以引物Nf-Nr和TomF-TomR進行PCR擴增,分別檢測nec1和tomA基因。引物序列:Nf:5′-ATGAGCGCGAACGGAAGCCCCGGA-3′,Nr:5′-GCAGGTC-GTCACGAAGGATCG-3′[18];TomF:5′-GAGGCGTTGGTGG-AGTTCTA-3′,TomR:5′-TTGGGGTTGTACTCCTCGTC-3′[18]。引物Nf-Nr和TomF-TomR的擴增條件參考Wanner[18]和Flores-Gonzlez等[22]的方法。

1.7菌株致病性鑒定

1.7.1蘿卜幼苗法檢測致病性

對TxtAB1/TxtAB2引物PCR擴增呈陽性的菌株進行蘿卜幼苗試驗。試驗參考Dees等[15]和Flores-Gonzalez等[22]的方法進行。若菌株抑制蘿卜幼苗下胚軸的伸長[22]或組織異常膨大,非正常生長[15]則認為該菌株具有致病性。

1.7.2馬鈴薯致病性檢測

對7株txtAB陽性菌株和2株txtAB陰性菌株進行馬鈴薯致病性檢測。選用生產上感瘡痂病的馬鈴薯品種‘尤金’。所有種薯均為無病的原種一代,基質經121℃ 15 min高壓滅菌4次。播種后每盆緩慢澆入菌懸液500 mL接種,最終濃度為106cfu/cm3,陰性對照澆入等量的水,每種菌株3次重復。所有盆栽放置于溫室中,白天平均溫度控制在24℃左右,晚間平均溫度控制在16～18℃[2,23],自然光照。播種4周后再補澆一次等量的菌懸液。播種后前4周根據植株的需要澆水,保證每盆中澆入等量的水。4周后進入控水期,待植株出現缺水癥狀后再澆水以促進瘡痂病的發生[24]。12周后收獲,調查每盆中所有塊莖是否有病斑及病斑類型。

2　結果與分析

2.1鏈霉菌和致病鏈霉菌的分子鑒定

2012-2013年從黑龍江省4個地區采集的68個病樣中共分離出74株菌株。以PAF和PHR為引物對獲得的所有菌株進行PCR擴增反應,鑒定菌株均屬于鏈霉菌屬。以TxtAB1和TxtAB2為引物對鏈霉菌屬菌株進行PCR反應檢測致病性基因,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,共有26株菌株得到約為385 bp目標條帶,與預期一致,即該26株菌株為具有致病性(txtAB呈陽性)的菌株(表2)。各地所分離的菌株中致病性菌株所占的比例差異較大,其中杜蒙共分離出12株菌株,致病性菌株為10株,致病性菌株所占比例為83.3%,為所有地區中所占比例最大的,其次為克山,所占比例為43.3%,哈爾濱致病性菌株所占比例為25%,綏化地區為15.4%,是4個地區中最少的。

表2　致病性菌株PAI基因型統計表1)Table 2　PAI genotypes of putative pathogenic isolates

1) Tx:具有txtAB基因;N1:具有nec1基因;To:具有tomA基因。

Tx:txtABpositive; N1:nec1 positive; To:tomApositive.

2.2致病鏈霉菌的種類鑒定

2.2.1PCR鑒定致病菌的種類

為明確黑龍江省引起瘡痂病的鏈霉菌種類的多樣性,本研究采用根據16S rRNA基因設計的6對特異性引物(表1)鑒定S.scabies/S.europaeiscabiei、S.stelliscabiei、S.acidiscabies、S.bottropensis、S.turgidiscabies、S.aureofaciens。因S.scabies和S.europaeiscabiei的序列僅有幾個堿基的差別,16S rRNA基因擴增無法區分這兩個種,因此ScabF-ScabR引物PCR擴增呈陽性的菌株只能判定為S.scabies/S.europaeiscabiei[15]。以ScabF-ScabR為引物的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到約為1 278 bp的目標條帶(圖1),以TurgF-TurgR為引物的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到約為1 273 bp的目標條帶(圖2)。共獲得ScabF-ScabR引物陽性菌株21株,TurgF-TurgR引物陽性菌株3株。

圖1　引物ScabF/ScabR PCR 擴增產物Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products with primers ScabF/ScabR

2.2.216S rRNA序列測序結果

對菌株SH43-1和HEB15-1的測序結果與GenBank數據庫作BLAST比較,結果表明測序的2株菌株序列均為鏈霉菌16S rRNA基因序列。選取與測試菌株序列相似性較高的菌株作為參比菌株,采用鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹。結果表明菌株HEB15-1和菌株SH43-1與S.acidiscabies的親緣關系最近,相似性分別為99.47%和99.41%,三者聚為1支(圖3),故菌株SH43-1和HEB15-1為S.acidiscabies。

本研究共鑒定出S.scabies/S.europaeiscabiei21株,S.turgidiscabies3株,S.acidiscabies2株。S.scabies或S.europaeiscabiei占致病菌株的80.77%,是黑龍江省各地區的優勢菌株,杜蒙和克山兩地區的致病性菌株均為S.scabies/S.europaeiscabiei。哈爾濱地區分離的3株致病性菌株中共有2株S.turgidiscabies和1株S.acidiscabies,并沒有S.scabies/S.europaeiscabiei菌株;而來自綏化的菌株有S.scabies或S.europaeiscabiei、S.turgidiscabies和S.acidiscabies3種病原菌,是4個地區中致病菌種類最復雜的地區(表3)。

圖2　引物TurgF/TurgR PCR 擴增產物Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification products with primers TurgF/TurgR

圖3　根據16S rRNA基因序列構建的 neighbor-joining系統發育樹Fig.3　Neighbor-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences

2.3PAI基因型鑒定

對2.1中獲得的26株txtAB陽性菌株分別以引物TomF-TomR和Nf-Nr進行PCR擴增,分別檢測tomA和nec1基因。其PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,分別得到大小約392 bp 和700 bp 的目標條帶,與預期一致。

所有的致病性菌株(txtAB呈陽性)中共有4種PAI基因型,即nec1+/tomA+、nec1-/tomA+、nec1+/tomA-和nec1-/tomA-,同時具有nec1基因和tomA基因(nec1+/tomA+)的菌株占81%,無nec1基因、無tomA基因、nec1基因和tomA基因全無的菌株分別占3.84%、7.69%、7.69%。在S.scabies/S.europaeiscabiei和S.turgidiscabies中nec1+/tomA+均占主導地位。在S.scabies/S.europaeiscabiei中nec1+/tomA+占90%,在S.turgidiscabies中nec1+/tomA+占50%。來自杜蒙的所有菌株均為nec1+/tomA+,克山的菌株nec1+/tomA+約占78%,即該基因型在克山地區占主導地位。哈爾濱地區共有nec1+/tomA+和nec1+/tomA-兩個基因型,這兩個基因型各占50%;綏化地區出現3個基因型即nec1+/tomA+、nec1-/tomA+、nec1+/tomA-,分別占25%、25%、50%,是4個地區中基因型最復雜的地區(表3)。

表3　Streptomyces致病性(txtAB positive)菌株特征1)Table 3　Characterization of putative pathogenic (txtAB positive) Streptomyces isolates

1) Tx為具有txtAB基因, N1為具有nec1基因, To為具有tomA基因;+有致病作用,-無致病作用,NT為未測定。

Tx:txtABpositive; N1:nec1 positive; To:tomApositive;+: Pathogenicity; -:No pathogenicity; NT: Not tested.

2.4致病性鑒定

2.4.1蘿卜幼苗致病性鑒定

txtAB基因是編碼thaxtomin A的操縱子,而thaxtomin A可以影響細胞的有絲分裂使生長中的組織細胞膨大[25],抑制蘿卜幼苗的生長,甚至可以抑制蘿卜種子的萌發[15]。將26株txtAB呈陽性的菌株進行蘿卜幼苗致病性鑒定,所有菌株均可抑制蘿卜幼苗的生長。將消毒后的蘿卜種子置于培養8～10 d的txtAB陽性菌株中,8 d后調查結果。與置于空白OMA培養基中的蘿卜幼苗相比,接種于txtAB陰性菌株中的蘿卜幼苗可正常發芽生長,接種于txtAB陽性菌株中的蘿卜幼苗與菌株接觸的部位組織膨大,胚軸胚根部膨大且沒有根毛(圖4),或胚軸胚根部細弱彎曲無根毛(圖5)。nec1基因可以編碼一種引起植物組織壞死的蛋白質,tomA基因編碼與毒力相關的物質。在蘿卜幼苗試驗中具有nec1基因的菌株并沒有使蘿卜幼苗出現壞死,但與同時具有txtAB、nec1、tomA基因的菌株相比，缺少nec1基因或tomA基因的菌株對蘿卜幼苗的抑制作用較弱(圖5)。

圖4　致病性菌株(txtAB陽性)對蘿卜幼苗生長的影響Fig.4　Influences of pathogenic isolates (txtAB positive)on radish seedlings

圖5　不同PAI基因型菌株對蘿卜幼苗的影響Fig.5　Influences of different PAI genotype isolates on radish seedlings

2.4.2馬鈴薯致病性鑒定

接種txtAB陽性菌株的植株收獲的塊莖均有瘡痂病典型病斑,與蘿卜幼苗致病性鑒定結果一致(表3),表明用蘿卜幼苗鑒定txtAB陽性菌株是否為致病性菌株是可靠的。所有致病性菌株在塊莖上均可引起平狀病斑或凹狀病斑,無凸狀病斑出現。接種txtAB陰性菌株的塊莖無瘡痂病病斑出現(圖6)。雖然所有菌株在塊莖上均可引起凹狀病斑和平狀病斑,但PAI基因型為TxToN1的菌株在塊莖上引起的凹狀病斑所占比例較大,而TxN1和TxTo基因型菌株在塊莖上引起的病斑中平狀病斑所占比例較大(圖6)。

圖6　不同PAI基因型菌株對馬鈴薯塊莖的影響Fig.6　Influences of different PAI genotype isolates on potato tubers

3　討論

許多國家對瘡痂病的病原都進行了較為細致的研究,而我國對該病的研究主要集中在防治方法上,對病原的研究尚少,目前已報道的僅有石河子大學的杜鵑等[26]、甘肅農業大學康蓉等[27]以及河北農業大學的趙偉全等[28-29]分別對新疆、甘肅和全國馬鈴薯瘡痂病的病原進行了鑒定。趙偉全等利用生物學特性和16S rRNA序列分析對采自全國10個省區的30個致病性菌株進行了病原鑒定,其中源自黑龍江的致病性菌株3株,采樣地點為大慶市和密山市[28-29]。本研究是對黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌進行系統的研究和調查,從黑龍江省馬鈴薯種植面積較大的克山縣、綏化市、哈爾濱市、杜爾伯特蒙古族自治縣4個地區采集樣本,從中分離純化出具有鏈霉菌特征的菌株,根據16S rRNA基因的差異采用分子手段對所分離的菌株進行種類和致病性鑒定,并對具有致病性基因的菌株進行蘿卜幼苗致病性和馬鈴薯致病性檢測試驗。共獲得26株具有致病基因的菌株,共鑒定出S.europaeiscabiei/S.scabies21株、S.turgidiscabies3株和S.acidiscabies2株。其中S.europaeiscabiei/S.scabies為黑龍江省的優勢菌株,占80.77%；杜蒙和克山縣兩地的菌株均為S.europaeiscabiei/S.scabies；哈爾濱市的致病菌為S.turgidiscabies和S.acidiscabies；S.europaeiscabiei/S.scabies、S.turgidiscabies、S.acidiscabies3個種在綏化地區均有出現,說明這一地區的瘡痂病病原菌較復雜。本研究在黑龍江省內共鑒定出至少3種瘡痂病病原菌,這與趙偉全等人的報道存在差異。趙偉全等人認為黑龍江省內的瘡痂病病原菌為S.scabies[28-29],這種差異存在的原因可能是采樣地點不同而導致的,因不同地區的致病菌種類會因外界環境條件的不同而不同[10];另一可能的原因是2006年以來黑龍江省的瘡痂病病原菌發生了變化。

同時,本研究在進行馬鈴薯瘡痂病病菌種類分子鑒定中發現,部分種類瘡痂病菌的核酸中GC含量較高,使用常規PCR反應試劑很難擴增到目的條帶,從而影響試驗結果。因此,在應用分子技術鑒定瘡痂病菌種類時應根據實際情況適當選擇針對GC含量高的模板而設計的PCR反應緩沖液等試劑進行PCR擴增,以保證試驗的順利進行。

蘿卜幼苗致病性檢測試驗中,同時具有txtAB、nec1、tomA基因的菌株除抑制蘿卜幼苗胚軸部的伸長外,可使接觸培養物的一端(胚根或子葉)組織膨大,另一端生長則受到抑制(胚根部細弱彎曲或子葉不伸展),但缺少nec1基因或tomA基因的菌株僅在一定程度上抑制幼苗胚軸部的伸長,且抑制程度較弱。在馬鈴薯致病性檢測試驗中,txtAB呈陽性的菌株均使馬鈴薯塊莖上產生典型的瘡痂病病斑,且同時具有3個致病基因的菌株,在塊莖上產生的凹狀病斑居多。研究將會在今后幾年連續采集黑龍江省各地區的帶有瘡痂病病斑的塊莖,對獲得的大量菌株進行鑒定和PAI基因型分析,進一步探討PAI中3個基因是否存在相互作用及不同PAI基因型菌株致病性的差異,掌握黑龍江省各地區瘡痂病菌的種類和特征,進一步明確黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌種類的地理分布規律,為抗瘡痂病育種及綜合防治奠定基礎。

4　結論

黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌由S.europaeiscabiei/S.scabies、S.turgidiscabies和S.acidiscabies組成,其中S.europaeiscabiei/S.scabies為優勢菌株。黑龍江省瘡痂病病原菌存在nec1+/tomA+、nec1-/tomA+、nec1+/tomA-和nec1-/tomA-4種PAI基因型。綏化市的瘡痂病病原菌種類多,PAI基因型多樣性是4個地區中最復雜的。

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(責任編輯：田喆)

Species and pathogenicity identification ofStreptomycesspecies causing potato common scab in part of Heilongjiang Province

Xing Yingying1,Lü Dianqiu2,Wei Qi2,Wan Shuming2,Dong Xuezhi2,Qiu Cailing2,Jin Guanghui1

(1.College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing163319, China; 2. Virus-free Seedling Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin150086, China)

The present research was conducted to identify and characterize the pathogens of potato common scab. We sampled the potato tubers with scab lesions from 4 potato-planting areas in Heilongjiang Province from 2012 to 2013. We obtained totally 74 isolates from these scab lesions; on the basis of the differences in 16S rRNA sequences, the pathogenicity oftxtABpositive isolates was tested on radish seedlings or potatoes. We identified 21StreptomycesscabiesorS.europaeiscabieiisolates, threeS.turgidiscabiesisolates and twoS.acidiscabiesisolates from 26 putative pathogenic isolates, and there were 4 different pathogenicity island (PAI) genotypes amongst the pathogenic isolates:nec1+/tomA+,nec1-/tomA+,nec1+/tomA-andnec1-/tomA-.txtABpositive isolates were tested for pathogenicity on radish seedlings or potatoes.

potato common scab;Streptomycesspp.;pathogenicity island genotypes

2014-11-17

2015-03-13

國家科技支撐計劃項目(2012BAD06B02); 黑龍江省青年科學基金(QC2012C063); 國際合作項目(2013DFA31970)

E-mail:ghjin1122@163.com

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.005