一個水稻褐飛虱為害誘導型啟動子的克隆

關麗梅,　馬偉華,　林擁軍,　陳　浩*

(1.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室, 武漢　430070;2.江西省科學院, 南昌　330029)

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一個水稻褐飛虱為害誘導型啟動子的克隆

關麗梅1,2,馬偉華1,林擁軍1,陳浩1*

(1.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室, 武漢430070;2.江西省科學院, 南昌330029)

目前組成型啟動子在基因工程中的應用最為廣泛,然而驅動外源基因在各組織中持續恒定地表達可能引起植物發育遲緩等問題。誘導型啟動子能夠在特定條件下實現目的基因定時優勢表達,最大限度減少由于非必需蛋白在轉基因植物內的積累對其造成的傷害。依據基因芯片數據并通過定量RT-PCR驗證,找到了一個受水稻褐飛虱(Nilaparavatalugens)為害誘導表達基因(LOC_Os01g73940)。用PCR技術從秈稻品種‘TN1’的基因組中獲得Os01g73940上游1 953 bp的啟動子片段,命名為BPHIP。將BPHIP連接到帶有β-glucuronidase(GUS) 報告基因的植物表達載體上,通過農桿菌介導轉化水稻品種‘中花11’。通過GUS組織化學染色法及定量RT-PCR檢測證明,BPHIP是一個受褐飛虱為害和茉莉酸處理誘導上調的啟動子。利用此類啟動子在基因工程中可以減少對水稻生理方面產生的副作用,對抗蟲轉基因水稻具有良好的應用價值。

水稻;誘導型啟動子;褐飛虱;抗蟲;基因工程

近幾年,全國病蟲草鼠害年均發生面積達4.67億hm2,雖然通過各種防治手段挽回大量經濟損失,但是每年仍損失糧食達4 000萬t。農作物病蟲害除了造成產量損失外,還能造成農產品品質下降,出現腐爛、霉變等,甚至產生對人體有毒、有害的物質。一些主要病、蟲害對作物生產具有嚴重威脅,例如,稻飛虱、螟蟲等蟲害以及水稻稻瘟病、水稻白葉枯病、水稻紋枯病、小麥條銹病、白粉病、赤霉病、油菜核菌病、棉花枯萎病等。因此,防治植物病蟲害,對保障國家經濟發展、提高人民生活水平具有重大意義。隨著遺傳轉化技術的日益發展，基因工程技術被越來越廣泛地應用于農作物品種的改良。

啟動子是基因工程中構建表達載體的重要組成部分,它可以控制外源基因表達的起始、表達部位與強度。目前,轉基因植物中所使用的啟動子一般為組成型啟動子,其驅動外源基因在植物體內持續大量地表達,打破了植物原有的代謝平衡,增加了植株的代謝負擔,造成了物質和能量上的浪費,而且還可能影響食物的安全性[1-2]。而誘導型啟動子則可以較好地避免上述問題,比如水稻褐飛虱為害誘導型啟動子,當褐飛虱刺吸水稻時,啟動子被誘導使相應的基因高效表達,進而達到改良水稻相應性狀的目的[3-4]。

1　材料與方法

1.1植物材料與菌種

用于提取DNA和RNA的秈稻品種‘TN1’和

‘RH’,轉化受體粳稻品種‘中花11’均由華中農業大學徐才國教授提供;啟動子的克隆載體為DX2181b,由本室葉榮建博士改造;用于構建載體的大腸桿菌菌株為TOP10;轉化所用農桿菌菌株為EHA105;兩種菌株為本實驗室保存。

1.2啟動子的克隆及植物表達載體的構建

利用本實驗室水稻接種褐飛虱誘導的基因表達芯片數據,挑選褐飛虱為害誘導表達基因。結合RiceXPro 3.0數據庫(http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/),挑選出在‘TN1’和‘RH’品種中均受褐飛虱為害誘導表達,且在胚乳中表達量極低的水稻基因LOC_Os01g73974。通過芯片的雜交信號值對其表達量的高低進行一個粗略的估計,預測此基因上游序列為褐飛虱誘導表達啟動子。設計引物BPHIP-F和BPHIP-R,并在引物的5′端引入Hind Ⅲ和PstI酶切位點(引物序列見表1)。利用‘TN1’的基因組DNA,對該基因翻譯起始位點上游約2 kb的啟動子區段進行擴增,所獲得的啟動子片段命名為BPHIP。PCR反應體系為:100 ng/μL基因組DNA 1 μL,10×buffer 2 μL,2 mmol/L dNTPs 4 μL,10 μmol/L BPHIP-F 0.2 μL,10 μmol/L BPHIP-R 0.2 μL,5 U/μLTaqDNA 聚合酶 0.2 μL,ddH2O 12.4 μL。反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,30 個循環;72℃ 延伸10 min。

PCR產物用Hind Ⅲ和PstI酶切后,連接到植物表達載體DX2181b相應的酶切位點之間獲得重組質粒,命名為DX2181-BPHIP(圖1),測序驗證。

當主電源接入24 V時，高于23 V的標準工作電壓，此時E1使能，控制G1產生下拉電流，Q1導通，此時V1=Vs>V2，G2產生上拉電流，Q2、Q3截止，避免產生逆向電流；當主電源接入電壓低于21 V時，E2使能，控制G2產生下拉電流，Q2、Q3導通，此時V2=Vs>V1，G1產生上拉電流，Q1截止，避免產生逆向電流.

圖1　終表達載體DX2181-BPHIP的T-DNA區域示意圖Fig.1　Schematic diagram of the T-DNA region of the final expression vector DX2181b-BPHIP

1.3農桿菌介導的遺傳轉化

利用本實驗室建立的水稻農桿菌介導的遺傳轉化法[7],以粳稻品種‘中花11’成熟種子的胚誘導后產生的愈傷組織為轉化受體,用帶有表達載體的根癌農桿菌EHA105進行侵染,侵染后用含有50 mg/L的潮霉素培養基篩選2次,每次2周,獲得抗性愈傷組織,經分化、生根得到轉基因植株。

取轉基因植株幼苗葉片提取基因組DNA,以其作為模板進行PCR檢測,擴增報告基因GUS的部分片段(引物為GUS-F和GUS-R,序列見表1),預期PCR產物大小為699 bp。

表1　本研究中所涉及的引物1)Table 1　PCR primers used in this study

1) 下畫線代表該引物所加酶切位點。

The underlined letters indicate the restriction enzyme site.

PCR反應體系:100 ng/μL 模板1 μL,10×buffer 2 μL,2 mmol/L dNTPs 4 μL,10 μmol/L GUS-F 0.2 μL,10 μmol/L GUS-R 0.2 μL,ddH2O 12.4 μL,TaqDNA 聚合酶0.2 μL。反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,28 個循環;72℃ 延伸8 min。PCR擴增呈陽性的植株保留,陰性植株去除。

1.4褐飛虱為害處理及JA處理

取不同水稻材料種子去殼,用1.5%升汞表面消毒后,在1/2 MS培養基上發芽生長約10 d。每個材料挑選6株長勢健康且相近的水稻植株移栽,其中3株移栽一盆準備進行接蟲處理,另3株移栽一盆不做任何處理作為對照。移栽后待水稻幼苗長至三葉一心階段,進行褐飛虱接蟲處理。平均每株接種約10頭2齡褐飛虱若蟲,然后每盆均用紗網罩住防止若蟲逃逸。接蟲6 h或24 h后對地上部分進行取樣,樣品用于GUS組織化學染色分析或RNA提取和定量PCR檢測。

茉莉酸(JA)處理的前期準備同褐飛虱為害處理,只是水稻植株進行水培液培養[8]。水培液加入JA (100 μmol/mL,Sigma-Aldrich)進行培養,且每隔2 h用含有相同濃度JA的水培液噴灑水稻葉片1次,共噴施3次。JA處理24 h后取水稻幼苗根部以上部分進行分析,其中少量葉片和葉鞘樣品進行GUS組織化學染色分析,其余樣品用于RNA提取和定量PCR檢測。

1.5GUS組織染色

將葉片和葉鞘樣品剪成合適大小,浸沒于GUS染色液中,抽真空后置于37℃恒溫培養箱內染色過夜。隨后,用無水乙醇脫色2次,每次1 h,最后用75%乙醇脫色至葉片綠色脫盡,然后用萊卡解剖鏡觀察拍照。

1.6定量RT-PCR檢測

采用TriZol Reagent (Invitrogen)試劑盒提取總RNA。具體操作步驟參照試劑盒說明書。RNA反轉錄步驟簡述如下,取2 μg 總RNA至Rnase-free 1.5 mL離心管中,加入1 μL DNase I,1 μL 10×緩沖液,加DEPC處理過的水至總體積10 μL,混勻后短暫離心,25℃(室溫)孵育15 min。加入1 μL 0.5 mol/L EDTA,混勻后短暫離心,65℃水浴10 min滅活DNase I。加入1 μL oligo d(T)18, dNTPs 1 μL,65℃水浴10 min,然后立即置冰上3 min,短暫離心。加入5×First strand buffer 4 μL,DTT 1 μL,反轉錄酶M-MLV 1 μL,RRI 1 μL混勻后短暫離心,于50℃水浴反應2 h。75℃水浴滅活15 min。加水適當稀釋反轉錄得到的cDNA。

實時熒光定量PCR使用ABI7500 (Life TechnologiesTM)檢測系統,使用試劑盒為FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche)。反應體系:100 ng/μL cDNA 1 μL,Mixture 5 μL,10 μmol/L左右引物各0.2 μL(所有引物序列見表1),ddH2O 3.6 μL。反應程序為:95℃ 10 min；95℃ 10 s,60℃ 36 s,40個循環。

2　結果與分析

2.1Os01g73940基因表達模式分析

根據本實驗室李昌焱等的褐飛虱接蟲誘導全基因組表達芯片分析的數據,不論是敏感品種‘TN1’還是高抗品種‘RH’,Os01g73940基因均受褐飛虱為害特異性誘導上調表達,且在‘TN1’中上調表達的幅度高于‘RH’。此外,在未處理或用針刺模擬褐飛虱為害處理中,Os01g73940基因表達量無顯著變化,說明Os01g73940是一個褐飛虱為害誘導特異性表達的基因(圖2a)。為了驗證基因芯片的數據是否可靠,我們利用定量RT-PCR方法對Os01g73940基因在褐飛虱為害條件下表達變化進行了檢測。無論是‘TN1’還是‘RH’,褐飛虱接種6 h后,Os01g73940基因表達水平僅有輕微上升;褐飛虱接種24 h,Os01g73940基因表達水平顯著上升,其中‘TN1’中表達上調6倍以上,而在‘RH’中表達上調5倍以上(圖3)。定量RT-PCR分析結果與基因芯片分析結果基本一致,證明基因芯片分析的結果是可靠的。

圖2　Os01g73940基因在褐飛虱接種和JA處理下表達量的變化Fig.2　Expressional pattern of Os01g73940 gene under brown planthopper infection and JA treatment

圖3　定量RT-PCR驗證Os01g73940基因在褐飛虱為害6 h和24 h后的表達模式Fig.3　Validation of the expression pattern of Os01g73940 gene 6 h and 24 h after brown planthopper infection by real-time RT-PCR

根據http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/下載的基因芯片數據分析,Os01g73940基因的表達還受植物激素JA的誘導(圖2b)。Os01g7390基因在JA處理0.5 h后就有輕微上調表達,處理3 h后表達上調明顯,處理6 h后表達進一步升高。根據http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP下載的全生育期各種組織器官基因表達芯片數據分析,Os01g73940基因的表達主要集中在葉片、葉鞘和莖稈等綠色組織中,而在根、花特別是胚乳中表達量很低(圖4)。

2.2啟動子克隆、表達載體構建及轉化

以‘TN1’總DNA為模板,采用PCR的方法克隆出Os01g73940的上游長度為1 953 bp的啟動子區段,命名為BPHIP。將BPHIP啟動子構建于GUS報告基因上游,并利用農桿菌介導的轉化法,將融合的GUS報告基因導入粳稻品種‘中花11’中,獲得的轉基因植株通過PCR驗證,共獲得31株T0陽性獨立轉化植株。

2.3褐飛虱接種和JA處理24 h后GUS組織化學染色分析

T0代陽性植株的種子在含有潮霉素的1/2 MS培養基上發芽,篩選陽性T1代植株3個家系進行接褐飛虱及JA處理,24 h后進行GUS組織化學染色分析。以野生型‘中花11’作為陰性對照。本實驗室先前轉化得到一個CaMV35S啟動子與GUS報告基因構建的融合基因的轉基因家系,該轉基因家系中GUS報告基因組成型表達,作為本研究的陽性對照。GUS組織化學染色結果顯示,啟動子BPHIP在水稻苗期的葉片和葉鞘部分均有一定的本底表達,在褐飛虱接種及JA處理24 h后GUS活性似乎有所上升,但無論褐飛虱接種或JA處理的前后,BPHIP啟動子驅動GUS基因表達的活性顯著低于組成型的CaMV35S啟動子(圖5)。

圖4　Os01g73940在水稻各組織的表達譜(根據http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP下載的數據制作)Fig.4　Expression profile of Os01g73940 in various rice tissues

圖5　GUS組織化學染色分析Fig.5　GUS histochemical staining analysis

2.4褐飛虱接種及JA處理后GUS基因表達量的定性分析

為了對BPHIP啟動子的表達活性進行定量分析,我們對經過褐飛虱接種和JA處理24 h后,轉基因家系GUS基因的轉錄本用定量RT-PCR進行了定量分析。由于處理褐飛虱接種和JA處理過程較為繁瑣,我們從31個獨立的陽性轉基因植株中隨機挑選3個轉基因植株家系作為代表進行了檢測(圖6)。結果表明,褐飛虱接種及JA處理24 h后GUS基因的表達量均有上調,與芯片數據預測的結果基本一致。褐飛虱接種24 h后3個轉基因家系GUS轉錄本平均上調2.78倍,最高上調倍數為4.38倍。與CaMV35S啟動子相比較,在未處理的條件下,GUS基因平均表達水平是CaMV35S啟動子的1/27;接蟲誘導24 h后平均表達水平可達CaMV35S啟動子的1/7。JA激素處理24 h后比未處理24 h平均上調倍數為2.68倍,最高上調倍數為3.17倍。與CaMV35S啟動子相比較,在未處理的條件下,GUS基因平均表達水平是CaMV35S啟動子的1/30;JA處理24 h后平均表達水平可達CaMV35S啟動子的1/7。

圖6　BPHIP啟動子驅動GUS基因的表達量檢測Fig.6　Detection of the expression of GUS report gene derived by BPHIP promoter

3　討論

在李昌焱等的芯片數據中,我們發現了數十個褐飛虱誘導上調表達基因,其中上調幅度最大的基因在褐飛虱接蟲誘導24 h后,表達上調可達90倍以上。但是,誘導上調幅度大的基因通常表達的本底水平低,即使經過褐飛虱誘導后的基因表達水平仍然很低。部分這類基因的啟動子克隆后,接GUS報告基因轉化水稻，即使褐飛虱為害誘導24 h后,在轉基因水稻中利用GUS組織化學染色甚至檢測不到明顯的GUS染色活性表達。此外,我們還發現一些褐飛虱誘導型基因僅在特定基因型如抗性品種中,才有基因誘導表達效應。我們將一些這類基因的啟動子克隆后,與GUS基因融合導入褐飛虱敏感水稻品種‘中花11’中,發現這些啟動子在敏感品種中誘導表達效果遠不如原始基因那么強,甚至沒有明顯的誘導表達效果,說明這樣的啟動子的誘導依賴特異性的基因組背景,而不具有普遍適用性。

雖然,Os01g73940基因受褐飛虱為害誘導的上調表達的幅度并不是很大(5～6倍),但無論是褐飛虱敏感品種背景還是褐飛虱抗性品種背景,該基因均可受褐飛虱為害誘導,說明該基因啟動子的誘導效果不受水稻品種基因型的限制,具有普遍性。此外,根據表達芯片數據預測,Os01g73940的啟動子具有一定的組織特異性,表達主要集中在莖葉等綠色組織,而在水稻害蟲不直接為害的花和種子中基本沒有表達。因此BPHIP啟動子是一個誘導型兼組織特異性啟動子。在NCBI網站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上檢索Os01g73940基因的同源蛋白,幾乎沒有相關研究,其基因功能未知。該基因推測的蛋白產物分子量較小,據預測可能是信號受體或膜蛋白。

本研究所得到的BPHIP啟動子不僅受到褐飛虱為害誘導,還受JA處理誘導。據報道,昆蟲接觸植物后首先給植物造成不同程度的機械損傷,引起植物體內JA和過氧化氫等信號分子積累水平的改變并激活防御反應化合物如蛋白酶抑制基因的表達[9-10]。此外，不同口器類型(如咀嚼式或刺吸式)的昆蟲對激活植物體內的防御信號也不同[11]。表明JA信號途徑廣泛參與植物應答蟲害的抗性反應,已經鑒定出水稻中OsERF是可以通過調控JA的合成來調節植物應對蟲害的免疫反應[12]。褐飛虱取食水稻后,體內激素信號會相應改變,從而引起一些基因表達模式的相應變化。因此，對于某些基因來說,褐飛虱取食和激素處理都可能會引起其表達量的改變。

本文所得到的啟動子BPHIP是一個新的褐飛虱誘導表達的啟動子,水稻的葉片和葉鞘又是許多病蟲害發生部位,該啟動子經過優化改造后,非常有望應用于抗蟲或抗病水稻的研究中。后續將此啟動子進行缺失分析,進而鑒定其核心功能元件的大致范圍,還需通過凝膠阻滯試驗等鑒定方法,找出該啟動子中與褐飛虱誘導相關的順式作用元件,分析其在轉錄調控中的分子作用機理,使其能夠在農業生產上得以有效利用。

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(責任編輯：田喆)

Cloning of a brown planthopper (Nilaparavatalugens) infection inducible promoter in rice

Guan Limei1,2,Ma Weihua1,Lin Yongjun1,Chen Hao1

(1.National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University,Wuhan430070, China； 2.Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang330029, China)

The constitutive promoters are widely applied in plant genetic engineering. However, it may cause growth retardation and other adverse effects due to the constant expression of exogenous genes in transgenic plants. The inducible promoters can control the expression of target genes more economically and minimize the possible harms to transgenic plants due to the accumulation of non-essential proteins. Based on the analysis of DNA microarray and quantitative RT-PCR, we found the expression of a rice gene (LOC_Os01g73940) could be induced by brown planthopper infection. The 1 953 bp upstream region ofOs01g73940 gene was isolated from the indica rice variety ‘TN1’ by PCR, which was referred to as brown planthopper induced promoter (BPHIP). BPHIP was ligated with aβ-glucuronidase(GUS) report gene to construct a fusion gene, and then transformed into a japonica rice variety ‘Zhonghua 11’. The results of GUS histochemical staining and quantitative RT-PCR confirmed that BPHIP is a promoter induced by brown planthopper infection and jasmonic acid treatment. This inducible promoter may mitigate the possible adverse effects of constitutive promoters in genetic engineering and has enormous application potential in insect-resistant transgenic breeding.

Oryzasativa;inducible promoter;Nilaparavatalugens;insect-resistance;genetic engineering

2014-11-23

2015-01-07

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0810-002)

E-mail:chenhaoxy2003@126.com

S 435.112.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.004