超高效液相色譜-串聯質譜法檢測水稻和土壤中氟唑菌酰胺的殘留及消解動態

路彩紅,　楊　林,　申流柱,　劉　路,姚　賽,　吳　希,　張　盈,　段婷婷*

(1. 貴州省畢節市農產品質量安全監督檢驗測試中心, 畢節　551700;2. 貴州省農業科學院植物保護研究所, 貴陽　550006)

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超高效液相色譜-串聯質譜法檢測水稻和土壤中氟唑菌酰胺的殘留及消解動態

路彩紅1,楊林1,申流柱1,劉路1,姚賽1,吳希1,張盈2,段婷婷2*

(1. 貴州省畢節市農產品質量安全監督檢驗測試中心, 畢節551700;2. 貴州省農業科學院植物保護研究所, 貴陽550006)

本文采用QuEChERS方法,建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)快速測定氟唑菌酰胺在水稻糙米、水稻殼、水稻植株、稻田水和土壤樣品中的殘留分析方法。樣品經乙腈提取,十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)凈化后采用外標法進行定量分析。添加濃度為0.1、0.5和1 mg/kg時,氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的平均回收率為82.7%～111.7%,變異系數為1.6%～13.0%,氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的最低檢出濃度LOQs 分別是18.89、2.85、10.27、30.21和3.21 μg/kg。該方法的準確度和精密度等均符合農藥殘留分析的要求。田間試驗結果表明,氟唑菌酰胺在水稻植株中的消解動態符合一級動力學方程,安徽、廣西和北京三地的水稻植株上的消解半衰期分別為2.5、3.8和9.9 d,表明氟唑菌酰胺屬于易降解農藥。

氟唑菌酰胺;水稻;土壤；UPLC-MS/MS;殘留

氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)化學名稱3-(二氟甲基)-1-甲基-N-(3′,4′,5′-三氟[1,1′-聯苯]-2-基)-1H-吡唑-4-甲酰胺,分子式C18H12F5N3O,分子量381.3,化學結構式見圖1。氟唑菌酰胺屬于羧酰胺類化合物,其作用方式是對線粒體呼吸鏈的復合物Ⅱ中的琥珀酸脫氫酶起抑制作用,從而抑制靶標真菌的孢子萌發,芽管和菌絲體生長。田間試驗表明其對小粒谷物、蔬菜和大豆等多種作物上的真菌病害表現出高的選擇性和極好的預防和治療作用[1],可廣泛用于谷物、水果和蔬菜等多種作物[2-3]。目前,僅歐盟制定氟唑菌酰胺在稻米上的最大殘留限量值(MRL)是0.01 mg/kg，我國尚未建立相關MRL值。因此研究氟唑菌酰胺在水稻上的殘留分析方法對該農藥在我國殘留限量標準的制定和保證食品安全具有重要意義。

圖1　氟唑菌酰胺的化學結構式Fig.1　Chemical structure of fluxapyroxad

劉磊等采用固相萃取凈化,高效液相色譜法檢測草莓中的氟唑菌酰胺殘留量[4];Dong等建立了氟唑菌酰胺在谷物(稻米和小麥)、水果和蔬菜中的殘留分析方法,但僅報道了氟唑菌酰胺在稻米中的殘留分析方法[5]。除此之外,目前尚未見其他氟唑菌酰胺殘留量測定方法研究的報道,且氟唑菌酰胺在水稻上的消解動態研究,亦是空白。

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測氟唑菌酰胺在水稻植株、稻殼、糙米、土壤和稻田水樣品中的殘留分析方法。該方法操作快捷簡便,能有效地去除干擾,提高靈敏度,且定性定量準確,能完全滿足氟唑菌酰胺在水稻植株、稻殼、糙米、土壤和稻田水中殘留量的快速檢測和確證。同時應用該方法進一步研究了12%氟菌·氟環唑乳油在水稻植株中的消解,為該農藥在水稻上的合理使用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

三重四極桿串聯質譜聯用儀(Acquity UPLC-TQD,美國Waters 公司);Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm;Milford,MA,USA);XW-80A漩渦混合器(美國Scientific Industries公司);L550離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

氟唑菌酰胺標準品(97.5%)及12% 氟菌·氟環唑乳油來自巴斯夫(中國)有限公司; C18粉末(40 μm)、N-丙基乙二胺(PSA,40 μm)和石墨化炭黑(GCB,40 μm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司;乙腈(色譜純,美國Honeywell International公司);NaCl和無水MgSO4均為分析純。

1.2田間試驗設計

參照《農藥殘留試驗準則》(NY/T 788-2004)[6],于2013年分別在廣西、安徽和北京三地進行12%氟菌·氟環唑乳油在水稻植株上的殘留消解動態試驗。于水稻采收期,采用兌水噴霧方式噴施藥劑1次,劑量為90 mL/667 m2(有效成分162 g/hm2,為推薦最高劑量的1.5倍)。每處理小區面積30 m2,灌水深度4～6 cm,重復3次,小區隨機排列,另設清水空白對照區,小區之間設保護帶。分別于噴藥前、噴藥后2 h、1、2、4、7、14、21、28 d取水稻植株樣品。稻田水、土壤、糙米和稻殼在空白對照區取樣。在每個試驗小區內隨機選6～12個采樣點采集水稻植株和稻穗不少于2.0 kg,水稻植株切碎混勻,稻穗研磨后使稻殼和糙米分離,四分法留樣500 g。土壤和水樣本的采集:空白區隨機取點5～10個,用干凈礦泉水瓶灌裝水樣品1 000～2 000 mL,用土鉆采集0～10 cm的土壤1～2 kg,除去水和土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物,混勻后四分法留樣500 g,-20℃低溫冷凍保存待測,其余樣品拋棄。小區邊行和每行距離兩端0.5 m內不采樣。

1.3分析步驟

1.3.1標準品的配制

稱取適量標準品用色譜純乙腈溶解，得100 mg/L的氟唑菌酰胺儲備液,并用乙腈稀釋配制成1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/L的系列標準品溶液。于-20℃低溫冷凍保存待測。3個月后,經優化后的檢測條件測試,標準溶液未降解。

1.3.2樣品前處理

(1) 水稻植株、土壤、糙米和稻殼:準確稱取植株和稻殼樣品各5 g,土壤和糙米樣品各10 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中,加入5 mL超純水,再加入10 mL乙腈,然后振蕩10 min,隨后在植株、稻殼樣品中加入3 g無水硫酸鎂和2 g氯化鈉,土壤、糙米樣品中加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉,迅速劇烈振蕩3 min, 4 000 r/min離心5 min,移取1.5 mL上清液加入裝有凈化劑(土壤和糙米為150 mg無水硫酸鎂、30 mg C18和10 mg GCB;稻殼為150 mg無水硫酸鎂和50 mg C18;水稻植株為150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA)的2 mL微型離心管中,渦旋1 min, 5 000 r/min離心5 min,上清液經0.22 μm有機濾膜過濾到進樣小瓶中, 貯存于-20℃待測。

(2) 稻田水:準確吸取10 mL稻田水于50 mL聚四氟乙烯離心管中,加入10 mL乙腈,振蕩10 min,加入4 g無水硫酸鎂,1 g氯化鈉,迅速劇烈振蕩3 min, 4 000 r/min離心5 min,取1.5 mL上清液,加入裝有150 mg無水硫酸鎂和30 mg C18的2 mL微型離心管中,渦旋1 min,在5 000 r/min離心5 min,上清液經0.22 μm有機濾膜過濾到進樣小瓶中, 貯存于-20℃待測。

1.4儀器測定條件

采用超高效液相色譜-串聯質譜,三重四級桿檢測器測定。Acquity UPLC BEH C18色譜柱,柱溫45℃,進樣體積3 μL。采用二元梯度洗脫分離,以0.2%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相,梯度洗脫條件為:0～0.5 min,10%～60% A;0.5～1.8 min,60%～90% A;1.8～2.0 min,90%～10% A;2.0～4.0 min,10% A;流速0.3 mL/min。

質譜條件為:電噴霧離子源,負離子電離模式(ESI-);毛細管電壓3.0 kV, 離子源溫度120℃,去溶劑氣溫度 350℃,去溶劑氣流量為600 L/h,錐孔反吹氣50 L/h,錐孔電壓44 V。采用多反應檢測模式(MRM)。以保留時間和兩個離子對380 >131(碰撞電壓24 eV)及380 > 248(碰撞電壓21 eV)進行定性分析,以母離子和響應值最高的子離子組成的離子對380 >131進行定量分析。氟唑菌酰胺的保留時間為2.68 min。

2　結果與分析

2.1檢測條件的優化

在電噴霧離子源下,將0.5 mg/L氟唑菌酰胺標準溶液在100～500 m/z內掃描,根據其化學結構式判斷,選正離子和負離子電離模式,只獲得特征離子峰[M-H]-,進一步選擇合適的監測離子和碰撞能量等質譜參數,最終選擇的檢測條件如“1.4節”。由圖2a可以看出,在此條件下標準溶液的峰形及重現性較好,靈敏度較高。按照“1.3節”的前處理方法處理樣品,水稻植株中氟唑菌酰胺的色譜圖見圖2。

圖2　氟唑菌酰胺標準溶液及氟唑菌酰胺在水稻植株中的色譜圖Fig.2　Chromatograms of standard fluxapyroxad solution and fluxapyroxad in rice plants

2.2提取溶劑及凈化劑的選擇

提取溶劑的選擇:由于糙米、水稻植株和稻殼的基質組分比較復雜,甲醇提取物含有太多雜質,將有可能干擾目標色譜峰,故采用乙腈作為提取溶劑。

樣品凈化過程凈化劑的選擇:首先選用了主要用于反相萃取的C18和主要用于正相萃取的PSA兩種典型的凈化劑。C18主要用于從極性樣品中去除非極性和中等極性化合物；而PSA由于具有較弱的陰離子交換功能,主要用于吸附非極性樣品中有機酸、糖類和脂肪等化合物[5,7]。用30 mg C18凈化糙米、土壤和水中的氟唑菌酰胺(添加水平為0.1 mg/kg)時,除水中氟唑菌酰胺能獲得滿意的平均回收率外,在糙米和土壤這兩種基質中氟唑菌酰胺的平均回收率均小于70%,且糙米提取液顏色非常渾濁,初步判斷是因疏水性的化合物如色素等沒有被完全吸附,這樣的提取液如果批量進樣會縮短儀器壽命。GCB是一種弱極性或非極性吸附劑,可以去除基質中疏水性化合物如葉綠素等雜質,因此在選用30 mg C18的基礎上,添加10 mg 的GCB來凈化糙米和土壤樣品。試驗結果證明,以30 mg C18和10 mg GCB為凈化劑,糙米和土壤中的氟唑菌酰胺可以獲得滿意的回收率,且糙米提取液的顏色明顯清澈。由于粉碎后的稻殼具有較大的體積,初步選用了50 mg C18作為凈化劑,試驗結果也獲得了滿意的回收率。由于水稻植株樣品中有較多的色素、有機酸、糖類和酚類等,選用對這些陰離子化合物具有很好的保留作用,且本身對于一些極性色素和糖類具有強親和力和高容量的PSA來去除,可獲得滿意的分析結果。

2.3方法的線性

按照“1.4節”確定的檢測條件, 對濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L的氟唑菌酰胺標準溶液進行色譜分析,以峰面積為縱坐標(Y),進樣濃度為橫坐標(X),進行線性回歸,結果顯示,在 0.01～1.0 mg/L的范圍內線性關系良好,線性方程為Y=128 150X+3 399.4,相關系數r=0.997 3。進一步配制系列相同濃度的基質匹配標準溶液來評估方法的線性相關性,通過基質匹配標準溶液與溶劑標準溶液得出的標準曲線的斜率比判定基質效應,結果證明斜率比在90%～110%之間,可判定無基質效應[8-9]。本研究采用溶劑標準曲線法直接進行樣品定量。

2.4方法的準確度、精密度和靈敏度

本研究采用添加回收率和相應的變異系數來衡量方法的準確度和精密度。在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中分別添加0.1、0.5、1.0 mg/kg的氟唑菌酰胺,每個水平重復5次。由表1結果可知,氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的平均回收率范圍是82.7%～111.7%,變異系數為1.6%～13.0%,符合殘留量測定的要求[6,10]。

表1　氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的添加回收率及變異系數(n=5)

方法的LOD和LOQ分別以添加回收試驗的最低添加水平0.1 mg/kg的色譜圖中信噪比(S/N)的3倍和10倍確定,得出氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的LODs分別是5.67、0.86、3.08、9.06和0.96 μg/kg,最低檢出濃度LOQs 分別是18.89、2.85、10.27、30.21和3.21 μg/kg。

2.5氟唑菌酰胺在水稻植株中的消解動態

田間試驗結果顯示,氟唑菌酰胺在北京、安徽和廣西三地水稻植株上的原始沉積量分別為1.58、1.67和2.43 mg/kg。隨時間的延長氟唑菌酰胺的殘留量逐漸下降,水稻植株上的氟唑菌酰胺的殘留量與施藥后間隔時間呈指數關系,C=AeBt。從氟唑菌酰胺在水稻植株中消解動態方程和相關參數(表2)可知,氟唑菌酰胺在安徽、廣西和北京三地水稻植株中的半衰期分別是2.5、3.8和9.9 d,表明氟唑菌酰胺屬于易降解農藥(t1/2<30 d)。從氟唑菌酰胺在水稻植株上的消解動態曲線(圖3)可知,安徽和廣西的消解情況較為一致,北京的消解時間較長,這可能與北京的氣候有關。

圖3　氟唑菌酰胺在水稻植株上的消解動態曲線Fig.3　Dynamic curve of fluxapyroxad in rice plants

地點Location回歸方程Regressionequation相關系數(r)Correlationcoefficient半衰期/dHalf-life安徽Anhuiy=1.1513e-0.2780x0.8992.5廣西Guangxiy=0.9728e-0.1804x0.9033.8北京Beijingy=1.9240e-0.0701x0.8029.9

3　結論

本研究在QuEChERS方法基礎上,建立了采用UPLC-MS/MS分析水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的氟唑菌酰胺殘留的分析方法。氟唑菌酰胺在水稻植株、土壤、糙米、稻殼和稻田水中的平均回收率范圍是82.7%～111.7%,變異系數為1.6%～13.0%,LODs分別是5.67、0.86、3.08、9.06和0.96 μg/kg,最低檢出濃度LOQs 分別是18.89、2.85、10.27、30.21和3.21 μg/kg。結果表明該方法雜質干擾小,有良好的線性、準確性、精密度和較低的檢測限。12%氟菌·氟環唑乳油在水稻植株上的殘留消解動態試驗表明,氟唑菌酰胺在安徽、廣西和北京三地水稻植株中的半衰期分別是2.5、3.8和9.9 d,表明氟唑菌酰胺降解較快。

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(責任編輯：楊明麗)

Residues and degradation determination of fluxapyroxad in rice and soil by UPLC-MS/MS

Lu Caihong1,Yang Lin1,Shen Liuzhu1,Liu Lu1,Yao Sai1,Wu Xi1,Zhang Ying2,Duan Tingting2

(1. Bijie Supervision and Testing Center of Agricultural Products Quality & Safety, Guizhou551700, China;2. Institute of Plant Protection, Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang550006,China)

A rapid, highly sensitive and selective method was developed for determination of fluxapyroxad by QuEChERS coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The target compound was extracted with acetonitrile, and cleaned up with primary secondary amine (PSA), graphitized carbon black (GCB) or octadecylsilane (C18). Average recoveries for rice plant, paddy soil, brown rice, rice hull and water at three spike levels (0.1, 0.5 and 1.0 mg/kg) ranged from 82.7% to 111.7% with coefficients of variation of 1.6% to 13.0%, and the limit of quantifications (LOQs) were 18.89, 2.85, 10.27, 30.21 and 3.21 μg/kg, respectively. Therefore, the established method was suitable for the determination of fluxapyroxad residues in rice. The field experiments demonstrated that the degradation of fluxapyroxad in rice plant was conformed to the first-order dynamic equation. The results showed that the half-lives of fluxapyroxad were 2.5, 3.8 and 9.9 days in rice plants from Anhui, Guangxi and Beijing, indicating that fluxapyroxad was easily degradable in the rice eco-system.

fluxapyroxad;rice;soil;UPLC-MS/MS;residue

2015-07-12

2015-09-06

貴州省自然科學基金([2015]2101號)

E-mail:gzdtt@126.com

S 481.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.021