芝麻枯萎病菌毒素成分分析及其對芝麻幼苗的毒性

朱強賓,　張海洋,　段迎輝,　常淑嫻,　魏利斌,　李　春,　苗紅梅*

(1. 南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室, 南京　210095;2. 河南省農業科學院芝麻研究中心, 鄭州　450002)

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研究報告

芝麻枯萎病菌毒素成分分析及其對芝麻幼苗的毒性

朱強賓1,張海洋2,段迎輝2,常淑嫻2,魏利斌2,李春2,苗紅梅2*

(1. 南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室, 南京210095;2. 河南省農業科學院芝麻研究中心, 鄭州450002)

芝麻枯萎病(sesameFusariumwilt, SFW)是由尖孢鐮刀菌芝麻專化型[FusariumoxysporumSchl. f.sp.sesami(Zap.),FOS]引起的一種土傳真菌病害,嚴重影響著我國芝麻生產。為確定FOS是否產生毒素以及毒素成分,利用液相色譜和液質聯用等技術分離并分析了FOS菌株培養濾液的主要組成物質。研究發現FOS能夠產生4種特異物質,分別為鐮刀菌酸(5-丁基吡啶甲酸,FA),及C10H13NO4(FA+O2)、C10H13NO3(FA+O)和C10H11NO2(FA-H2)3種鐮刀菌酸類似物。在Richard培養基上強致病力和弱致病力FOS菌株均可獲得毒素,不同致病力的菌株所產生 4種物質的含量和比例存在差異。芝麻幼苗生長試驗結果證明含有上述特異物質的FOS培養濾液能夠對幼苗生長產生抑制作用;而隨著FOS毒素濃度的增大,芝麻幼苗受毒害程度增大。但在含相同FA濃度的FOS培養濾液處理下,不同芝麻品種幼苗生長受抑制程度無顯著差異。該結果為進一步研究FOS致病機理及芝麻-FOS互作奠定了技術和理論基礎。

芝麻枯萎病;毒素;鐮刀菌酸;液相色譜;液質聯用

芝麻(SesamumindicumLinn.,2n=26)屬胡麻科胡麻屬,是世界上最古老的優質油料作物,也是我國重要的特色油料作物。芝麻枯萎病(sesameFusariumwilt)由尖孢鐮刀菌芝麻?；?Fusariumoxysporumf.sp.sesami,FOS)侵染引起,與莖點枯病并稱為芝麻兩大主要真菌病害[1]。芝麻枯萎病在中國、印度、蘇丹、埃及、巴基斯坦等芝麻生產國發生普遍[2-5]。我國芝麻枯萎病害主要發生在東北、華北、西北、黃淮以及江淮部分地區,常年發生率在15%左右,嚴重影響芝麻產量和品質。為探明芝麻枯萎病菌致病機理,國內外先后開展了枯萎病菌分離、鑒定以及病原菌致病力鑒定方法等研究[2, 6-7]。2009年以來,我國采用人工單一枯萎病圃率先開展了芝麻枯萎病抗性鑒定與評價以及抗病分子標記篩選研究(數據未公開發表);仇存璞等首次建立了芝麻枯萎病菌致病力室內鑒定技術體系,為芝麻FOS致病以及芝麻抗枯萎病機理研究提供了技術支撐[2]。已有研究結果顯示,尖孢鐮刀菌在侵入植株組織后多能產生毒素,并對植株造成毒害作用[8-11]。2006年臺蓮梅等利用尖孢鐮刀菌毒素濾液評價了不同大豆品種對根腐病的抗病性,并將該方法用于大豆抗病植株的初篩工作[12]。近期初步研究表明,芝麻枯萎病菌FOS同其他尖孢鐮刀菌相似,侵染芝麻后,菌絲體逐漸堵塞維管束,切斷水分及營養物質供應,從而導致植株發病。同時,FOS能夠產生果膠酶、纖維素酶等水解酶,對芝麻植株起到侵染作用(河南省農業科學院科研檔案記載)。但至今人們尚未明確芝麻枯萎病菌是否能夠產生毒素,亦未見有關FOS毒素成分及其對芝麻毒害癥狀的公開報道。為此,本文開展了芝麻枯萎病菌FOS毒素主要成分研究,并分析了FOS菌液對芝麻幼苗的毒害特征,為下一步開展FOS致病機理及芝麻-FOS互作研究奠定技術和理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

尖孢鐮刀菌芝麻專化型強致病力菌株HSFO09100和弱致病力菌株HSFO07021(表1)由河南省農業科學院芝麻研究中心植物病理室分離并保存。

用于FOS毒素毒性檢測的芝麻品種‘豫芝11號’、‘鄭芝98N09’、‘榮縣黑芝麻’和‘冀9014’的種子由河南省農業科學院芝麻研究中心種質資源庫提供。

表1　所用尖孢鐮刀菌芝麻?；途晏卣魈匦?)

1) 菌株HSFO07021及HSFO09100由河南省農業科學院芝麻研究中心病理室分離保存。菌株均使用PDA培養基同等條件下培養并完成特征特性觀察。菌株致病力評價參照仇存璞等[2]的方法進行。

The two FOS isolates HSFO07021 and HSFO09100 are collected and conserved by Laboratory of Sesame Pathology, Henan Sesame Research Center, China. The pathogens are cultured on PDA medium and the characters are recorded. The pathogenic level of the two FOS isolates is measured according to the method of Qiu et al[2].

1.2FOS培養濾液的制備

挑取HSFO09100和HSFO07021菌株(-70℃保藏)的少量菌絲,于28℃下,在PDA平板上培養7 d。用無菌打孔器在菌落邊緣打出直徑為8 mm的菌片3～5個,接入裝有Richard培養液的三角瓶內,28℃、120 r/min下振蕩培養20 d。用滅菌紗網過濾去除大部分菌絲后,用0.22 μm濾膜濾除殘留菌絲和孢子,濾液用于FOS毒素分析和毒性檢測。

1.3FOS毒素成分分析

選用Agilent 1100液相色譜儀和AichromBond-AQ C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱對1.2制備的FOS菌株濾液進行毒素成分分析和分離。以Richard培養液作為空白對照。流動相為A(乙酸水溶液,pH=3)和B(乙腈);進樣量為25 μL;梯度洗脫程序:① 0～5 min,A為95%,B為5%;② 5～22 min,A為95%～68%,B為5%～32%;③ 22～25 min,A為68%～95%,B為32%～5%;流速為1.0 mL/min,柱溫30℃,檢測波長為270 nm。記錄菌液色譜圖特異峰;將各收集液旋轉蒸發濃縮,即得到較純的FOS毒素溶液。

1.4FOS毒素主要成分的LC-ESI-MS圖譜鑒定與結構分析

使用液質聯用質譜儀(UPLC-QTOF,xEVO G2,美國)對分離純化的特異峰物質進行分析。液相條件同上。質譜測試條件:離子源為電噴霧ESI,正離子掃描;噴霧電壓1 600 V,離子源溫度120℃,離子進料毛細管溫度350℃;鞘氣30 L/min;輔助氣10 L/min。分辨率為70 000;掃描范圍為150～1 800 M/Z。根據FOS提取物中各推測物質的分子式,通過儀器自動搜索分析,推測確定活性物質的結構信息[5]。

1.5鐮刀菌酸標準曲線制作及含量檢測

以超純水為溶劑,選用鐮刀菌酸(FA)標準品(Sigma,美國)配制60、150、300、500、800和1 200 μg/mL梯度標樣溶液,每個濃度重復3次。以峰面積為x坐標,FA質量濃度為y坐標,建立FA標準曲線。選用Agilent 1260型高效液相色譜儀確定測試FOS濾液的FA含量。液相色譜使用條件同上。

1.6FOS培養液對芝麻幼苗的毒性評價

采用1.2方法,以Richard培養液培養并獲得HSFO09100和HSFO07021菌株過濾液,將適量菌株濾液加入MS培養液,使MS培養液中的鐮刀菌酸濃度分別為1、5和10 μg/mL,然后在每1 L MS培養液中加入5 g瓊脂粉,121℃高壓滅菌后冷卻待用;以無菌水和加入新鮮Richard培養液的MS固體培養基為空白對照。

挑選飽滿健康的‘豫芝11號’、‘榮縣黑芝麻’、‘鄭芝98N09’和‘冀9014’種子各500粒,清水沖洗種子表面3～5遍。將種子浸泡于75%乙醇30 s,無菌水沖洗3遍;隨后用3%次氯酸鈉浸泡10 min,無菌水沖洗種子3～4遍;將消毒后的種子放入裝有10 mL無菌水的三角瓶中振蕩培養2 h。挑選露白的芝麻種子,分別接種在上述MS固體培養基上,25℃、L∥D=14 h∥10 h下培養。每個處理設3個重復,每個重復接種10粒種子,2周后測量芝麻幼苗鮮重、根長、苗高,并拍照記錄。

2　結果與分析

2.1尖孢鐮刀菌芝麻?；途昱囵B液分析

先前研究結果表明，多個尖孢鐮刀菌種在侵入植物組織后均可產生毒素,并對植株造成毒害作用[8-11]。為明確尖孢鐮刀菌芝麻?；褪欠癞a生毒素以及毒素成分,我們首先選用Richard液體培養基培養強致病力菌株HSFO09100和弱致病力菌株HSFO07021,20 d后將2份培養液中的孢子和菌絲等活體濾除,對濾液分別進行Agilent 1100液相色譜分析,以新鮮液體培養基作空白對照(圖1)。菌液液相色譜比對結果顯示,與空白培養液相比,HSFO09100和HSFO07021的菌株濾液色譜均存在4個明顯的特異峰(圖1a～b)。弱致病力菌株HSFO07021中4個特異峰位置分別為保留時間4.35 min(Ⅰ)、9.06 min(Ⅱ)、17.45 min(Ⅲ)和20.78 min(Ⅳ)(圖1a);強致病力菌株HSFO09100中的4個特異峰位置分別為4.31 min(Ⅰ)、9.13 min(Ⅱ)、17.50 min(Ⅲ)和20.65 min(Ⅳ)(圖1b)。a～d各特異峰在兩個菌株濾液中出現的時間極其接近。

圖1　FOS菌株Richard培養濾液液相色譜分析Fig.1　HPLC chromatogram analysis of the filtered FOS suspension cultured in Richard solution

進一步比較兩個FOS菌株去孢子濾液的液相色譜圖,可以看出,4個峰物質的面積存在差異(表2)。在弱致病力菌株HSFO07021中,保留時間為9.06 min(Ⅰ)、17.45 min(Ⅲ)和20.78 min(Ⅳ)的峰面積大于保留時間4.35 min(Ⅰ)的峰面積值,保留時間20.78 min(Ⅳ)的峰面積最大;在強致病力菌株HSFO09100中,保留時間20.65 min(Ⅳ)的峰面積最大,顯著大于其他3個特異峰面積。此外,比較兩個菌株濾液中4個特異峰的峰面積發現(表2),菌株HSFO07021中特異峰Ⅰ～Ⅲ的峰面積均大于菌株HSFO09100,而HSFO07021中特異峰Ⅳ的峰面積(7 913 mAU·s)則小于菌株HSFO09100(28 386 mAU·s),峰面積比率為1∶3.59。隨后依據該物質標準曲線,初步確定特異峰物質Ⅳ在HSFO07021濾液中的實際含量為569 μg/g,在HSFO09100中的實際含量為1 927 μg/g。上述結果表明,在同一培養條件下,不同致病力FOS菌株所產生4種特異物質的量有明顯差異。

表2　FOS菌株Richard培養濾液中特異峰Ⅰ～Ⅳ的峰面積

2.2尖孢鐮刀菌芝麻?；途舅爻煞?/p>

為分析特異峰物質結構,利用Agilent 1100分別收集了上述FOS濾液中的Ⅰ～Ⅳ特異峰物質,濃縮后進行LC-ESI-MS分析(圖2)。在HSFO07021菌株濾液分析結果中,4個特異峰(Ⅰ～Ⅳ)對應的4種物質分子離子峰m/z分別為212.092 3、196.097 3、178.087 0和180.102 4,分子量較為接近;且在HSFO09100菌株濾液中各特異物質分子離子峰出現的時間與菌株HSFO07021中保持一致。

圖2　HSFO07021菌株Richard培養濾液Ⅰ～Ⅳ特異峰物質的質譜分析Fig.2　Mass spectrometry analysis of the four isolated components in the filtered Richard culture solution of HSFO07021 strain

推測分析顯示,在HSFO07021菌株產生的4種峰物質中,保留時間為20.78 min的Ⅳ峰物質分子量為180.102 4,與鐮刀菌酸(fusaric acid, FA)的分子量大小一致;推測其分子式為C10H13NO2,結構式為5-丁基吡啶甲酸。為進一步判定Ⅳ峰物質是否為鐮刀菌酸,我們選用FA標準品(Sigma)水溶液為對照,對HSFO07021和HSFO09100菌株濾液進行了液相色譜比對。分析發現,FA標準品的特異峰值出現在20.5 min,與兩個菌株濾液的Ⅳ特異峰的誤差小于±5%,保留時間較為一致(圖略)。

我們進一步分析了Ⅰ～Ⅲ 3個主要特異峰物質的LC-ESI-MS圖譜,并計算了各物質的分子量(表3)。從表中可以看出,Ⅰ～Ⅲ峰物質與FA均具有相似解離基團,與FA的結構差異在于增加1～2個O原子或者減少2個H原子,物質分子式分別為C10H13NO4(FA+O2)、C10H13NO3(FA+O)、C10H11NO2(FA-H2)和C10H13NO2(FA)。4種物質的質量測定值和理論質荷比數據極為接近,差異在0～0.000 5。由此,我們確定FOS菌株能夠產生鐮刀菌酸FA及多種鐮刀菌酸類似物,這些物質統稱為FOS毒素。

表3　HSFO07021菌株培養濾液中4個主要峰物質的HPLC-ESI-MS檢測

2.3FOS毒素對芝麻幼苗的毒性分析

為評價FOS菌株產生的FA和FA類似物對芝麻的毒害作用,分別用含有1、5和10 μg/mL FA的HSFO07021和HSFO09100菌株濾液處理萌發的‘豫芝11號’、‘鄭芝98N09’、‘榮縣黑芝麻’和‘冀9014’種子,2周后調查統計幼苗生長情況(圖3,表4)。

圖3　不同FOS菌株濾液及濃度對‘豫芝11號’芝麻幼苗生長的影響Fig.3　Growth inhibition effects of the filtered culture solutions of different FOS strains with various FA concentrations on sesame seedlings of ‘Yuzhi 11’ variety

結果顯示,當FOS濾液中FA含量為1～10 μg/mL時,處理2周后芝麻幼苗無死亡現象。菌液對芝麻幼苗的抑制作用主要表現為子葉和真葉展開緩慢,葉片小而卷曲,莖稈細短,生根緩慢;部分處理表現根部紅褐(圖3,T3～T4)。從表4中可以看出,當菌株濾液中FA的濃度為1 μg/mL時,芝麻幼苗的生長受抑制程度不明顯或不受抑制;而當菌株濾液中FA的濃度為5～10 μg/mL時,芝麻幼苗的生長則受到不同程度的抑制;且隨著菌液中FA含量的增大,幼苗生長受抑制明顯。其中,當HSFO09100濾液中的FA含量由1 μg/mL增加到10 μg/mL時,‘豫芝11號’鮮重由0.197 g降為0.038 g,根長由12.2 cm降為0.2 cm,苗高由8.6 cm降為2.0 cm,差異顯著。

表4　FOS菌株去孢子濾液對芝麻幼苗生長的抑制1)

1) 表中數據為平均值±標準誤。同列數據后不同的小寫字母表示經Duncan’s方差分析,在P=0.05水平上差異顯著。

Data in the table are mean±SE.The data followed by different lowercase letters indicate significant difference atP=0.05 level.

進一步比較上述HSFO07021和HSFO09100菌株的Richard培養濾液對4個芝麻品種的作用,可以發現在同等FA濃度處理下,除個別指標有顯著差異外,4個芝麻品種幼苗生長的受抑程度相似。利用含有5 μg/mL FA的HSFO09100濾液處理4個芝麻品種,植株鮮重變化范圍為0.053～0.067 g,苗高變化范圍為2.9～3.8 cm,處理間差異不明顯。

3　討論

3.1FOS毒素成分分析

尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)是侵染經濟作物的一類主要病原菌[10],其產生的鐮刀菌酸,可對植株造成毒害作用。臺蓮梅等曾使用活性炭法較好地提取了尖孢鐮刀菌毒素[8]。芝麻枯萎病由尖孢鐮刀菌芝麻?；?FOS)侵染引起,至今未見有關FOS毒素成分分析及其對芝麻毒害作用的報道。在真菌毒素研究中,人們多采用液相色譜和液質聯用技術分離、純化真菌毒素。采用GC-MS技術可以檢測到谷物、谷類食品、飼料、豬排泄物中的T-2毒素[13]。李赤等利用液相色譜、氣相色譜儀和質譜等技術從香蕉枯萎病菌毒素里分離出了7種活性成分[14]。本試驗利用液相色譜和液質聯用技術成功分析了FOS產生的4種特異物質,分別為鐮刀菌酸(5-丁基吡啶甲酸,FA)和其他3個類似物(C10H13NO4(FA+O2)、C10H13NO3(FA+O)、C10H11NO2(FA-H2))。鐮刀菌酸是一種常見鐮刀菌屬毒素,最早由Yabuta等從異孢鐮孢(FusariumheterosporumNees)中分離得到[15]。本研究結果進一步證實FOS病菌能夠產生鐮刀菌酸和3種FA類似物,這些物質對芝麻生長有毒害作用。隨著鐮刀菌酸(1～10 μg/mL)的增加,FOS培養濾液對芝麻幼苗生長的抑制和毒害作用加大,表明芝麻枯萎病菌FOS能夠產生有毒害作用的毒素。此外,我們進一步分析了不同培養液條件下強致病力菌株HSFO09100和弱致病力菌株HSFO07021產生的毒素種類。結果顯示強、弱致病力FOS菌株在Czapek、Richard和低碳Richard等培養基中均能夠產生FA以及FA+O2、FA+O和FA-H2等3種FA類似物(數據未公開)。上述研究結果為深入開展芝麻枯萎病菌致病機理及生物防控技術研究提供了目標靶向。

3.2FOS毒素作用與菌株致病性的關系

大量研究表明真菌毒素在病害發生、發展過程中起著重要作用。毒素能夠抑制寄主的生長,破壞寄主細胞質膜、細胞器等結構,對植株光合作用、核酸代謝、蛋白合成等功能造成影響。吳洪生等研究證明了鐮刀菌酸能夠嚴重損壞葉細胞,且隨著毒素處理時間的延長和毒素濃度的增加,細胞受到的傷害更快、更重[16]。郭新梅等研究表明毒素濃度越大,品種(系)的膜透性增加,毒素對細胞膜的傷害愈嚴重[17]。但有研究認為鐮刀菌毒素在低濃度時具有類激素活性效應,高濃度時則表現為毒害作用[9]。Seong選用5個棉花枯萎病菌株的培養液濾液處理芝麻種子,發現低濃度濾液對芝麻種子萌發和幼苗生長有促進作用,高濃度濾液對芝麻萌發和生長有抑制作用[9]。本研究結果顯示,弱致病力菌株HSFO07021和強致病力菌株HSFO09100均可產生鐮刀菌酸及其類似物;當菌株濾液中的FA濃度為1～10 μg/mL時,菌株濾液對4個芝麻品種的幼苗生長造成了顯著性抑制作用。幼苗表現為真葉發育、植株高度均受影響;植株生長受抑程度與菌液中的FA濃度呈正相關。

毒素在病原菌致病過程發揮著重要作用,但人們在病原菌毒素產量與其致病力關系方面的研究結果不盡相同。蔣荷等[11]研究認為黃瓜種傳尖孢鐮刀菌的毒素產量與菌株是否具有致病性并不一定相關;另有部分研究認為菌株粗毒素產量、毒性與致病力強弱正相關[18-19]。在先前的芝麻枯萎病菌致病性研究中,我們發現HSFO09100在‘豫芝11號’、‘鄭芝98N09’、‘榮縣黑芝麻’和‘冀9014’中均表現出強致病性的特征,而HSFO07021在上述4個品種中均表現為弱致病性。本研究中,我們對HSFO07021和HSFO09100的毒素成分和毒害作用進行了比較分析。雖然HSFO07021和HSFO09100產生的毒素種類相同,但不同毒素物質的含量和比例存在明顯差異。與HSFO07021相比, 在菌株HSFO09100的Richard培養液中以鐮刀菌酸為主,其他3個FA類似物含量較少。用鐮刀菌酸濃度相同的2個菌株濾液處理芝麻時,其毒害作用無顯著差異。該結果或許表明FOS菌株的致病力強弱與產毒能力有一定關系。此外,研究中我們發現,在Czapek、Richard、低碳Richard等不同培養條件下,同一菌株產生的毒素數量也有差異(數據未公開)。下一步我們將研究芝麻枯萎病菌產毒條件和調控,探明不同FOS菌株產毒能力與致病力強弱的內在關系。

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(責任編輯：田喆)

Identification of the toxin of sesame Fusarium wilt pathogen and its toxic effect on sesame seedlings

Zhu Qiangbin1,Zhang Haiyang2,Duan Yinghui2,Chang Shuxian2,Wei Libin2,Li Chun2,Miao Hongmei2

(1.State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,China; 2. Henan Sesame Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou450002, China)

SesameFusariumwilt (SFW) caused byFusariumoxysporumf.sp.sesami(FOS) is a soil-borne fungus disease in sesame and has an effect on sesame production. In order to reveal whether FOS could produce toxin and determine the toxin components, we separated and analyzed the filtered culture solution of FOS strains by using HPLC and HPLC-MS techniques. Four separate peak masses in the main FOS filtered components were identified as fusaric acid (5-butylpicolinic acid, FA) and three fusaric acid analogues, namely C10H13NO4(FA+O2), C10H13NO3(FA+O) and C10H11NO2(FA-H2). With Richard culture medium, both the highly pathogenic strain (HSFO09100) and the lowly pathogenic strain (HSFO07021) could produce toxins; however, the content and ratios of the four main toxins varied evidently. The results proved that the FOS filtered solutions containing fusaric acid and the three analogues could inhibit the growth of the sesame seedlings. Moreover, as the concentration of fusaric acid in the filtered solutions increased from 1 to 10 μg/mL, the toxic effects to sesame seedlings became obvious. Growth comparison results indicated that no significant difference existed among the four sesame varieties under the treatments of FOS filtered solutions containing the same FA concentration. The results provide the technical and theoretical basis for further study on FOS pathogenicity mechanism and the interaction of FOS and sesame.

sesameFusariumwilt;toxin;fusaric acid;HPLC;HPLC-MS

2015-08-04

2015-08-30

國家現代農業(芝麻)產業技術體系(CARS-15)；國家自然科學基金(U1204318，U1304321，31301653)

E-mail: miaohongmeichina@yahoo.com

S 435.653

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.004

Research Reports