慢性腦缺血海馬CA1區(qū)HCN1蛋白表達下調(diào)與學習記憶損傷研究

孫莉　李進　郭蓮軍　陳玉華

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慢性腦缺血海馬CA1區(qū)HCN1蛋白表達下調(diào)與學習記憶損傷研究

孫莉李進郭蓮軍陳玉華

目的探討慢性腦缺血導致大鼠認知功能障礙與HCN1通道亞型蛋白表達變化的內(nèi)在關(guān)系。方法健康成年雄性SD大鼠20只，隨機分為假手術(shù)組、缺血組，每組各10只。各組缺血4周后采用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶功能，免疫組化檢測HCN1表達水平，進一步用蛋白印跡檢測HCN1蛋白表達水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；缺血組大鼠海馬CA1區(qū)HCN1蛋白表達水平明顯降低，與模型組比較有明顯差異(P<0.05)。結(jié)論慢性腦缺血海馬CA1區(qū)存在HCN1通道亞型表達下調(diào)且參與大鼠認知功能損傷，可能為治療慢性腦缺血所致認知功能障礙的新靶點。

慢性腦缺血學習記憶水迷宮實驗HCN1通道亞型

血管性癡呆(VD)是指由腦血管疾病所引起與學習記憶認知功能障礙有關(guān)綜合征[1]。我國VD 的患病率為逐年上升，嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量[2]。深入闡明血管性癡呆發(fā)生的病理生理生理機制為臨床治療尋找有效的干預措施極為重要。

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated cation channels，HCN)通道是電壓門控通道超家族中的一員，自上世紀末被發(fā)現(xiàn)以來，一直是神經(jīng)科學工作者研究的熱點課題。HCN 通道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布極為廣泛，對神經(jīng)元興奮節(jié)律、神經(jīng)網(wǎng)絡振蕩、樹突整合、突觸可塑性、遞質(zhì)釋放等均有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。分子生物學研究已發(fā)現(xiàn)HCN通道有4個亞型(HCN1-HCN4)[4]，在嚙齒類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛分布，其中HCN1在海馬、前額皮層等表達最為豐富[5]。文獻報道，HCN 通道參與學習和記憶的形成過程，HCN1 缺失可引起學習記憶功能損傷，其機制可能與樹突整合有關(guān)[6]。然而，在腦缺血誘發(fā)的血管性癡呆情況下HCN1在海馬CA1發(fā)生怎樣的變化尚未見報道。

本研究采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(2VO)制備慢性腦低灌性腦缺血模型，評價HCN1通道亞型在海馬CA1區(qū)的蛋白表達水平的改變，進一步探究2VO大鼠海馬CA1區(qū)HCN通道對學習記憶功能的調(diào)節(jié)作用，為血管性癡呆的防治提供新的干預靶點。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

水合氯醛，粉劑，購于國藥集團化學試劑有限公司(貨號：30037527，批號：20141011)，HCN1抗體(生產(chǎn)廠家：Novus(諾偉司)；貨號：NBP1-20250, 實驗時稀釋比例為1∶800)，所用其它試劑均為市售分析純。

1.2實驗動物

SD 大鼠，雄性，清潔級(2～3月齡，體質(zhì)量220～250 g)，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證編號：SCXK(E) 2010-0009，No.42000600005370)。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食，飲水，晝夜交替12 h，室溫控制在(25±5)℃，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。將大鼠隨機分成假手術(shù)組，2VO模型組。所有大鼠實驗操作均按華中科技大學動物倫理委員會有關(guān)條例規(guī)定執(zhí)行。

1.3方法

1.3.1慢性腦低灌注模型的制備

大鼠稱重，水合氯醛(350 mg/kg, ip)麻醉，切開頸部皮膚，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，用4-0手術(shù)縫線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的近心端和遠心端并剪斷，即2血管永久性結(jié)扎(2VO)，制備慢性腦低灌注缺血模型。假手術(shù)組大鼠僅暴露雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎。在整個手術(shù)期間大鼠體溫保持在(37.5± 0.5)℃，待大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)。 大鼠2VO 4周后應用Morris水迷宮(MWM)實驗評估各組大鼠空間學習記憶能力及取腦進行免疫組化和分子生物學實驗。

1.3.2 Morris水迷宮實驗

用于評價大鼠的空間學習記憶能力；實驗時將大鼠放入一圓柱形水槽[直徑2 m，高35 cm，水深為21 cm，水溫(25±3)℃]內(nèi)；水槽平面分為4個象限，將一直徑為8 cm，高20 cm 的玻璃平臺置于第Ⅱ象限；實驗于每天上午10∶00～12∶00 進行；每只大鼠每天進行4 次，每次隨機從1個象限入水1次，連續(xù)5 d，記錄每天大鼠找到平臺的時間，4個象限記錄的時間的平均值作為逃逸潛伏期(評價大鼠空間學習能力)；實驗第6 d撤去平臺，記錄大鼠在60 s 內(nèi)在原平臺放置象限(第Ⅱ象限，即為目標象限)的停留時間，作為評價空間記憶能力；大鼠游泳軌跡采用成都泰盟科技有限公司MT-200水迷宮圖像追蹤系統(tǒng)視頻監(jiān)測。

1.3.3免疫組織化學染色

水迷宮實驗結(jié)束后每組取3只大鼠麻醉，用4%多聚甲醛的PBS對大鼠進行灌流后斷頭取腦，快速冰凍切片(40 μm)；腦片用0.3% Triton X-100的PBS進行漂洗，隨后用5%的BSA封閉，4 ℃過夜孵育一抗anti-HCN1 (MAB1572, Millipore; 1∶800濃度)，一抗孵育洗滌后室溫孵育二抗2 h，二抗分別為DyLight 488 Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (A23210-1, Abbkine, 1∶200濃度)，二抗孵育后用Olympus Fluo View 1200共聚焦顯微系統(tǒng)拍照(放大倍數(shù)400×)。

1.3.4蛋白印跡實驗

水迷宮實驗結(jié)束后每組取7只大鼠麻醉迅速斷頭，分離海馬，冰凍切片(厚400 μm )，進一步在體視顯微鏡下分離出CA1區(qū)組織，用膜蛋白試劑盒提取海馬CA1區(qū)膜蛋白；應用BCA 試劑盒測定蛋白水平。取80 μg提取液，用10% SDS/PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h， TBST漂洗3次，各5 min；anti-HCN1 (1∶800), 用0.1% Tween-20 TBST 漂洗3 次(3×5 min)，將PVDF膜室溫下在HRP標記的二抗中孵育1 h；用0.1% Tween-20 TBST漂洗3次(3×5 min)，曝光，用NIH Image J 統(tǒng)計軟件測定蛋白條帶光密度值。

1.3.5統(tǒng)計學處理

所有計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，運用one/two-way ANOVA分析組間差異，P<0.05表示顯著性差異。

2　結(jié)　果

2.1大鼠慢性腦低灌注對學習記憶功能損傷的影響

水迷宮實驗顯示，假手術(shù)組與缺血組大鼠的游泳速度無顯著差異(P>0.05)。缺血組與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠找到平臺的潛伏期，顯著延長(n=10,P<0.05)(圖1)?？臻g記憶實驗顯示，大鼠在目標象限(第Ⅱ象限：Q2)的停留時間占總時間的百分率作為評估記憶殘留的指標。假手術(shù)組大鼠在目標象限Q2的停留時間顯著長于缺血大鼠(假手術(shù)組:39.53±5.08%,缺血組:20.19±5.03%,P<0.01)(圖2)。

圖1水迷宮實驗第1 d到第5 d 2組大鼠找到平臺的潛伏期與假手術(shù)組大鼠相比，缺血組大鼠的潛伏期顯著延長(n=10)

圖2水迷宮實驗第6 d大鼠空間記憶能力檢測與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠在靶標象限停留的時間顯著縮短(*P<0.01)

2.2慢性腦低灌注大鼠海馬CA1區(qū)HCN1表達水平的變化

免疫組化實驗顯示，大鼠慢性腦低灌注4周后HCN1蛋白在海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的表達明顯減少(圖3)。

圖3大鼠海馬CA1區(qū)HCN1和HCN2組織化學染色(×400倍)

經(jīng)蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，2VO 4周后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元HCN1膜蛋白表達顯著減少(n=5, 與假手術(shù)組相比，P<0.05)(圖4)。

圖42組大鼠海馬CA1區(qū)HCN1蛋白表達水平變化與假手術(shù)組比較，*P<0.05

3　討　論

以腦組織供血不足為病理特征而導致認知功能障礙稱為血管性癡呆，是癡呆發(fā)生的另一重要原因，臨床發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率僅次于老年性癡呆。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎4周后在空間學習記憶能力明顯受損時海馬CA1 區(qū)HCN1表達水平顯著降低，提示HCN1通過亞型可能參與慢性腦低灌注所致學習記憶損傷的病理調(diào)節(jié)過程。

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(HCN)通道是電壓門控通道超家族中的一員，其包含HCN1-4 四種亞型，廣泛分布于心臟和神經(jīng)系統(tǒng)。大量研究表明，在正常大鼠海馬HCN1亞型與其他幾種亞型共同介導產(chǎn)生Ih電流。電生理記錄顯示，Ih存在于少數(shù)突觸前膜，對突觸傳遞的調(diào)控有重要作用。有研究報道在小龍蝦運動神經(jīng)元終板當cAMP依賴性的Ih表達上調(diào)，突觸傳遞發(fā)生長時程易化，而突觸傳遞發(fā)生長時程易化是學習記憶形成的電生理基礎[7]。Phillips等報道Ih參與突觸整合和傳遞、而影響學習記憶的形成和鞏固[8]。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)與癲癇[9]、阿爾茨海默病[9]、帕金森綜合癥[10]、神經(jīng)性疼痛、精神情感障礙等疾病的發(fā)生、發(fā)展有較為密切的聯(lián)系[11]。

HCN通道功能受細胞內(nèi)cAMP水平調(diào)控， cAMP結(jié)合到通道的特定結(jié)合域(CNBD)上加速通道的開放[12]。在正常大鼠海馬HCN1亞型介導產(chǎn)生Ih電流對突觸傳遞的調(diào)控有重要作用。而在腦缺血缺氧的情況下由于缺血缺氧，細胞內(nèi)cAMP水平減少， HCN通道功能減弱。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海馬CA1區(qū)HCN1蛋白表達下調(diào)，神經(jīng)元的Ih電流減弱，可能引起整個海馬神經(jīng)突觸傳遞發(fā)生改變，而導致海馬依耐性的空間學習記憶功能受損。HCN1亞型參與介導的相關(guān)作用機制還有待進一步深入研究。

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(2016-01-03收稿2016-04-25修回)

Down-regulation and damage of learning and memory in chronic ischemic hippocampal CA1 area HCN1 protein expression

SunLi,LiJin,GuoLianjun,etal.

DepartmentofNeurology,GeneralHospitaloftheYangtzeRiver(WuhanBrainHospital),Wuhan430010

ObjectiveTo investigate the expression changes of HCN1 channel subtypes protein in chronic cerebral ischemia rats with cognitive dysfunction.MethodsTwenty healthy male SD rats were randomly divided into control group, the ischemia group. Four weeks after ischemia, we use Morris water maze to test Learning and memory function and detect HCN1 expression level through immunohistochemistry. Western Bloting further detect HCN1 protein expression level.ResultsCompared with the control group, the escape latency in ischemic group was significantly prolonged (P<0.05). In ischemia group, HCN1 protein expression level in hippocampal CA1 area decreased significantly, which has significant difference (P<0.05) compared with model group.ConclusionHippocampal CA1 area with chronic ischemic exists HCN1 channel expression down-regulation, participating in cognitive impairment in rats. It might be a new target of the treatment of cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.

Chronic cerebral ischemiaLearning and memoryMorris water mazeHCN channel subtypes

交通運輸部長江航務管理局課題(201210011)；武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學科研項目(WX14D12)

430010武漢，長江航運總醫(yī)院·武漢腦科醫(yī)院[孫莉李進陳玉華(通信作者)]；華中科技大學同濟醫(yī)學院藥理系(郭蓮軍)

R749.1+3

A

1007-0478(2016)04-0255-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.04.010