高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸和原兒茶酸

程麗林,張長峰,王慶國

(1.山東省農產品貯運保鮮技術重點實驗室,山東濟南 250103;2.山東農業大學食品科學學院,山東泰安 271018)

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高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸和原兒茶酸

程麗林1,2,張長峰1,王慶國2，*

(1.山東省農產品貯運保鮮技術重點實驗室,山東濟南 250103;2.山東農業大學食品科學學院,山東泰安 271018)

目的:建立高效液相色譜法測定馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸的含量,并測定了兩種馬鈴薯貯藏期間綠原酸、原兒茶酸含量的變化。方法:采用高效液相色譜法梯度洗脫,使用反相C18色譜柱,以1%甲酸水溶液和100%甲醇為流動相,流速為0.8 mL/min,柱溫:40 ℃,在326、280 nm波長處分別對綠原酸和原兒茶酸進行測定。結果:綠原酸、原兒茶酸分別在50～500、200～1000 μg/mL范圍內與峰面積線性良好,相關系數分別為0.9999、0.9992;精密度RSD均小于0.35%,穩定性RSD均小于1.68%,綠原酸、原兒茶酸重復性RSD分別為2.07%、3.58%,綠原酸、原兒茶酸平均加樣回收率分別為98.29%、97.81%,RSD分別為1.46%、1.31%(n=5)。結論:該方法線性范圍寬,分離效果好,快速、準確,可用于馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量的測定。

高效液相色譜法,馬鈴薯,綠原酸,原兒茶酸

馬鈴薯,茄科茄屬,是繼水稻、小麥、玉米之后的四大糧食作物之一[1]。馬鈴薯塊莖除含有豐富的淀粉、蛋白質、多種維生素和無機鹽成分外,還含有豐富的酚酸物質[2-3]。酚酸物質多為對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸的衍生物,是一類廣泛存在于植物體內的次生代謝產物,具有一定的抗氧化能力[2]。馬鈴薯塊莖中的酚酸類化合物包括綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、芥子酸、沒食子酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸、桂皮酸等多種成分[4]。其中綠原酸、原兒茶酸為馬鈴薯酚酸的主要成分[5]。酚酸物質其中的一種氧化反應就是酶促褐變,馬鈴薯鮮切后易發生褐變,而馬鈴薯中主要的酚酸物質是綠原酸、原兒茶酸,所以綠原酸、原兒茶酸含量的變化可能有褐變相關[6]。

目前,分析酚酸的方法有紫外分光光度法(UV)[7]、薄層層析法(TCL)[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-11]和高效毛細管法[12]等。應用較多的是紫外分光光度法和高效液相色譜法。張建華[13]建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯塊莖中綠原酸的含量。Therese M. Work[14]報道了采用高效液相色譜法測定了加工馬鈴薯中總酚的含量。Pirjo Mattila和Jarkko Hellstr?m[15]采用HPLC測定了馬鈴薯、蔬菜中酚酸的含量。

本文建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸含量。并采用該方法測定了克新4號、克新13號馬鈴薯鮮切后貯藏期間綠原酸、原兒茶酸含量的變化,為以后研究鮮切馬鈴薯綠原酸、原兒茶酸含量變化與褐變之間的關系提供了實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試馬鈴薯由黑龍江農業科學院克山馬鈴薯研究所李慶全助理研究員提供,品種為克新4號、克新13號,于2013年10月收獲,選擇大小均一,無病蟲害,無機械損傷的馬鈴薯為實驗材料;綠原酸(Chlorogenic Acid)標準品(HPLC≥98%,批號:20140126)、原兒茶酸(Protocatechuic Acid)標準品(HPLC≥98%,批號:20140126)上海金穗生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)美國Sigma公司。

Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣系統、Empower色譜軟件系統)美國Waters公司;反相C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),紫外2489檢測器美國Waters公司;KQ-250B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;UniversaL 320R臺式離心機德國Hettich公司;優普系列純水制造系統城都超純科技有限公司;EL204-IC電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品制備選擇大小均一、無機械損傷、無綠變新鮮馬鈴薯克新4號和克新13號,用水清洗除去表面污物,去皮,切成5 mm的切片,切片后放在保鮮袋中,放置在3～4 ℃環境下貯藏,分別在0、1/24、2/24、4/24、12/24、2、5、8、11、14 d進行取樣,將樣品切碎用液氮進行冷凍處理,再放置-70 ℃超低溫冰箱中進行凍存。參考Zhou,L-L[16]方法測定,有改動。將冷凍樣品在液氮冷凍多功能粉碎機中打碎,稱取果肉粉末0.2 g,加入0.8 mL甲醇甲酸混合(80%甲醇水溶液中含有1%甲酸)溶液,置于4 ℃冰箱中過夜浸提,浸提混合物在30 ℃下超聲振蕩提取30 min,然后離心(1000 r/min,30 min),剩余殘渣用0.5 mL甲醇甲酸混合溶液重新提取,再離心。合并兩次浸提液,進樣前經脫氣處理,再用0.45 μm的濾膜進行過濾。

1.2.2標準品溶液制備準確稱取綠原酸、原兒茶酸標準品各5 mg和10 mg,分別置于10 mL棕色容量瓶中,加入甲醇甲酸混合溶液溶解,并稀釋至刻度,得到綠原酸、原兒茶酸標準溶液。

1.2.3色譜條件色譜柱:反相C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A:1%甲酸水溶液;流動相B:100%甲醇溶液;流速:0.8 mL/min,柱溫:40 ℃;進樣體積:10 μL;綠原酸檢測波長為326 nm,原兒茶酸檢測波長為280 nm。流動相梯度表見表1。

表1　梯度洗脫表

1.2.4方法線性關系實驗:將配制好的0.5 mg/mL綠原酸標準溶液分別稀釋為50、100、200、300、500 μg/mL,以綠原酸濃度(μg/mL)(X)為橫坐標,以峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸分析。將配制好的1.0 mg/mL原兒茶酸標準溶液分別稀釋為200、500、700、900、1000 μg/mL,以原兒茶酸濃度(μg/mL)(X)為橫坐標,以峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸分析。精密度實驗:取綠原酸標準品200 μg/mL溶液10 μL,按照1.2.3項下色譜條件,重復進樣測定5次。穩定性實驗:準確稱取馬鈴薯樣品,按照1.2.1進行樣品制備,將樣品待測液放置4 ℃冰箱中保存,分別在2、4、8、16、24 h時按照1.2.3色譜條件進行測定。重復性實驗:準確稱取1 g馬鈴薯樣品5份,按照1.2.1進行樣品制備和1.2.3色譜條件進行測定,重復測定5次。加樣回收率實驗:準確稱取已知綠原酸、原兒茶酸含量的克新13號5 d的樣品6份,按照1.2.1進行樣品制備待測液,再分別加入綠原酸標準品(50 μg/mL)、原兒茶酸標準品(50 μg/mL)0.1、0.2、0.3 mL,制成樣品溶液,按照1.2.3項下色譜條件進行綠原酸及原兒茶酸含量測定,重復5次實驗,計算平均回收率及相對標準偏差。

1.2.5含量的測定在相同色譜條件下根據標準品、樣品峰面積與標準品含量,計算出原始樣品中綠原酸、原兒茶酸含量。

2　結果與分析

2.1線性關系實驗

進行線性回歸分析,得到線性回歸方程為:Y=4.248×104X-2.443×104(r=0.9999),綠原酸標準品濃度在50～500 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系(如圖2)。

圖1　50 μg/mL綠原酸標品HPLC色譜圖Fig.1　HPLC for 50 μg/mL standard chlorogenic acid

圖2　綠原酸標準品HPLC的線性關系Fig.2　HPLC linear relation for standard chlorogenic acid

進行線性回歸分析,得到線性回歸方程為:Y=2.062×104X+2.667×105(r=0.9992),原兒茶酸標準品濃度在200～1000 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系(如圖4)。

圖3　200 μg/mL原兒茶酸標品HPLC色譜圖Fig.3　HPLC for 200 μg/mL standard protocatechuic acid

圖4　原兒茶酸標準品HPLC的線性關系Fig.4　HPLC linear relation for standard protocatechuic acid

2.2精密度實驗

根據實際檢測值得出,綠原酸峰面積相對標準偏差(RSD)為0.29%(n=5)。取原兒茶酸標準品700 μg/mL溶液10 μL,重復進樣測定5次,根據實際檢測值得出,原兒茶酸RSD為0.34%(n=5),見表2,表明儀器精密度良好。

2.3穩定性實驗

測定綠原酸峰面積的RSD為0.67%,原兒茶酸峰面積的RSD為1.67%,綠原酸和原兒茶酸峰面積相對標準偏差較小,表明樣品溶液至少在24 h內穩定。

表2　精密度實驗結果

2.4重復性實驗

測定綠原酸峰面積RSD為2.07%(n=5),原兒茶酸峰面積的RSD為3.58%(n=5),重復性RSD較低,說明方法重復性較好。

2.5加樣回收率實驗

結果見表3。

表3　回收率測定結果(n=5)

表3結果表明,綠原酸平均加樣回收率為98.29%,RSD為1.46%,原兒茶酸平均加樣回收率為97.81%,RSD為1.31%,回收率較高,相對偏差較小。

2.6樣品含量的測定

采用本實驗所建立的HPLC方法測定了馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量。

圖5為空白樣品色譜圖。圖6、圖7是鮮切馬鈴薯0 h時,綠原酸和原兒茶酸含量測定的色譜圖。采用本實驗所建立的HPLC法測定了克新4號、克新13號鮮切貯藏過程中0、1/24、2/24、4/24、12/24、2、5、8、11、14 d綠原酸和原兒茶酸含量的變化。結果如圖8、圖9。

圖5　空白樣品HPLC色譜圖Fig.5　HPLC chromatogram for blank samples

圖6　綠原酸含量測定的HPLC色譜圖Fig.6　HPLC chromatogram for thecontent determination of chlorogenic acid

圖7　原兒茶酸含量測定的HPLC色譜圖Fig.7　HPLC chromatogram for the contentdetermination of protocatechuic acid

圖8　克新4、克新13綠原酸含量的變化Fig.8　The change of chlorogenic acid contentin Kexin No.4 and Kexin No.13

從圖8中可看出,0～12 h內,克新4號綠原酸含量為0 μg/g,2 d后克新13號綠原酸含量呈上升趨勢。在整個貯藏期間,克新4號綠原酸含量始終低于克新13號。綠原酸含量在貯藏過程中呈上升趨勢,主要原因是機械損傷誘發的主要次生代謝物質如各種酚類等通過苯丙烷類代謝途徑生成。

從圖9中可看出,克新4號0～2 h內原兒茶酸含量變化不明顯,2 h后呈下降趨勢,克新13號0～12 h內原兒茶酸含量變化不明顯,12 h后呈下降趨勢。在整個貯藏過程中,克新4號原兒茶酸含量始終高于克新13號,且整體呈下降趨勢。原兒茶酸含量在貯藏過程中呈下降趨勢,原因可能是原兒茶酸作為褐變底物參與了酶促褐變反應。

圖9　克新4、克新13原兒茶酸含量的變化Fig.6　The change of protocatechuic acid contentin Kexin No.4 and Kexin No.13

3　結論與討論

建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸及原兒茶酸含量,測定了貯藏期間兩種鮮切馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸含量的變化。CaoYu[17]也采用此方法測定了荷蘭7號馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸的含量。本實驗綠原酸、原兒茶酸在50～500、200～1000 μg/mL范圍內與峰面積線性良好,相關系數分別為0.9999、0.9992,相關性較高,符合實驗要求。精密度RSD分別為0.29%、0.34%,表明儀器精密度較高,穩定性RSD為0.67%、1.67%,重復性RSD為2.07%、3.58%,樣品穩定性、重復性較好。

馬玉榮[18]采用高效液相色譜法測定了馬鈴薯中主要的酚類物質,其采用甲醇提取,再進行55 ℃旋轉蒸發,制得檢測分析液,再在液相色譜條件下進行檢測液的測定。與本文方法相比,其檢測液的制備過程較繁瑣。張建華[13]采用高效液相色譜法測定了馬鈴薯中綠原酸含量,采用甲醇超聲浸提,在液相條件下進行檢測分析液的測定。駱成堯[4]采用了反相高效液相色譜法測定了馬鈴薯中的酚酸物質,采用70%甲醇超聲提取,再以甲醇-水-冰醋酸為流動相進行樣品的測定。與本文方法相比,他們所采用的流動相A、B溶液配制起來較為繁瑣。本方法提取較為簡單,選擇的流動相溶液配制方便,進行樣品檢測液液相操作簡便,可一同測定綠原酸和原兒茶酸含量。該方法具有簡單快速,線性范圍寬,分離效果好,數據準確、可靠等優點,可作為馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量測定的方法。

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Determination of chlorogenic acid and protocatechuic acid in potatoes by HPLC

CHENG Li-lin1,2,ZHANG Chang-feng1,WANG Qing-guo2，*

(1.Shandong Key Laboratory of Storage and Transportation Preservation Technology of Agricultural Products,Ji’nan 250103,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Objective:To establish a method of detecting the content of chlorogenic acid and protocatechuic acid in potato tuber by High Performance Liquid Chromatography(HPLC),this method was used to determine the change of chlorogenic acid,protocatechuic acid content in two species potatoes during storage. Methods:Gradient elution HPLC was used to determine chlorogenic acid and protocatechuic acid. The samples were separated by reversed-phase C18chromatographic column using 1%formic acid and 100% methanol as a mixed mobile phase. The detection wavelength was set at 326 nm and 280 nm respectively.The column temperature was set 40 ℃. Results:The calibration curves showed good linear relationship between the peak areas and concentrations was 50～500 μg/mL for chlorogenic acid,200～1000 μg/mL for protocatechuic acid,the related coefficient was 0.9999,0.9992. The RSD of precision were all lower than 0.35%. The RSD of stability were all lower than 1.68%. The RSD of repeatability was 2.07% for chlorogenic acid,3.58% for protocatechuic acid. Standard addition recovery of chlorogenic acid,protocatechuic acid was 98.29%,97.81% with relative standard deviation(RSD)of 1.46%,1.31%(n=5). Conclusion:The method was rapid,accurate with wind linear range and good separation results,which was suitable for the analysis of chlorogenic acid,protocatechuic acid in potato tuber.

HPLC；potato；chlorogenic acid；protocatechuic acid

2015-12-10

程麗林(1987-),女,碩士,研究方向:采后生理及技術,食品加工與安全,E-mail:chengll0816@163.com。

王慶國(1965-),男,碩士,教授,研究方向:采后生理及技術,E-mail:wqgyyy@126.com。

農產品品控物流關鍵技術裝備研發與應用(2014zzcx02701);山東省科技發展計劃“馬鈴薯物流保鮮關鍵技術及新產品研發與應用”(2014GNC113008);山東省現代農業產業技術體系薯類產業創新團隊產后貯藏加工崗位專家(SDAIT-10-011-11)建設任務。

TS207.3

A

1002-0306(2016)13-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.053