高光譜圖像法對稻谷貯藏中五種常見真菌生長擬合及區分

肖　慧,王振杰,孫　曄,顧欣哲,屠　康,都立輝,潘磊慶,*

(1.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023)

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高光譜圖像法對稻谷貯藏中五種常見真菌生長擬合及區分

肖慧1,王振杰1,孫曄1,顧欣哲1,屠康1,都立輝2,潘磊慶1,*

(1.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023)

利用高光譜成像系統(HIS)獲取稻谷貯藏中常見真菌(黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂板上培養期間的高光譜圖像,波峰709 nm處的光譜值和全波段光譜值的第一主成分得分兩種方法構建真菌Gompertz函數的生長模擬模型。Gompertz函數擬合結果顯示,五種真菌基于全波段光譜值PCA分析后的第一主成分得分建立的生長擬合模型R2為0.1781～0.9501,基于波峰709 nm光譜值建立的擬合模型R2為0.9095～0.9679,效果明顯優于第一主成分得分的建模效果。另外,主成分分析(PCA)結合偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)可以區分五種不同菌種。其中,訓練集和測試集中,PLS-DA模型對培養48 h的黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉、桔青霉四種真菌及對照組的區分準確率為100%;而對雜色曲霉,訓練集區分準確率為100%,測試集的區分率為33.33%。結果表明高光譜圖像技術能夠用來對真菌種類進行區分。

高光譜圖像,稻谷,真菌,生長擬合,區分

稻谷是我國主要儲備糧種。稻谷產量約占全國糧食總產量的38.3%[1]。稻谷貯藏中的真菌危害是一種常見現象,稻谷在貯藏中的真菌共有十幾種,主要屬于曲霉類和青霉類[2]。郜海燕等[3]對浙江省農家稻谷的調查發現在稻谷貯藏中曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鐮孢霉屬(Fusariumspp.)、彎孢霉屬(Curvulariaspp.)、鏈格孢霉屬(Alternariaspp.)為優勢菌,且在不同的地區及貯藏方式中,真菌的種類基本一致。稻谷中真菌的存在使得稻谷在貯藏過程中極易發生病變,加速了稻谷的變色,影響稻谷品質,造成稻谷的損失。同時,污染稻谷的霉菌會產生具有致畸、致癌、致突變“三致”效應的霉菌毒素,危害人體健康[4]。因此,建立稻谷貯藏常見真菌生長模型能對稻谷貯藏中真菌進行及時檢測及預測,降低稻谷損失,避免霉變稻谷造成消費者的食用風險。國外有專家采用修正的Gompertz模型,在玉米提取液培養基上模擬了影響霉菌菌種生長因素的研究[5-6]。Sautour等[5]利用PDA培養基對幾種霉菌的生長與水分活度之間的關系進行了模擬研究。李瑞芳等[8]利用PDA培養基對影響黃曲霉生長的因素進行了模擬研究。Gibson和Hocking[9]在1997年發表的綜述中描述了建立真菌生長模型的原則,并總結了在酵母菌及霉菌中應用的建模及預測技術。Baert等[10]建立了溫度對蘋果中青霉菌生長速率及遲滯期影響的模擬模型。青霉菌的模擬研究報道尚少,而且建立在高光譜基礎上的稻谷貯藏真菌的生長模擬和區分也沒有報道。

高光譜圖像技術是20世紀80年代發展起來的新技術,把傳統的成像技術與光譜技術有效結合,其光譜技術可以檢測產品的物理結構和化學成分;圖像技術可以反映外部特征,是用于農產品無損檢測中快速、準確的技術之一,具有較大應用前景[11]。高光譜圖像技術在遙感測量上有著成熟的應用背景,已在多領域取得了成功。近年來國內外的研究表明高光譜技術已被廣泛應用于水果的無損檢測中,Alan等[12]運用該技術對蘋果表面動物排泄物污染進行了檢測,Juan等[13]利用該技術對不同種蘋果表面的損傷進行了檢測,Qin 等[14]對膩斑病、潰爛果、蟲害果、黑變病果及帶疤痕果等210個柑橘樣品進行了識別及分類。但高光譜圖像在稻谷貯藏病害研究很少,本研究旨在分析稻谷儲藏中主要真菌(米曲霉、雜色曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、桔青霉)平板培養的高光譜特征,并通過對比信息,實現五種真菌的生長擬合和識別工作,為進一步實現稻谷基質儲藏真菌病害的生長和擬合奠定基礎,進而為稻谷真菌病害的準確檢測和監測提供幫助。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

稻谷儲藏主要的五種真菌黑曲霉(Asp.Niger,GIM3.462)、米曲霉(Asp.Oryzae,GIM3.470)、雜色曲霉(Asp.Versicolor,GIM3.473)、構巢曲霉(Asp.Nidulans,GIM3.270)和桔青霉(P.Citrinum,GIM3.458),由廣東菌種保藏中心購入。

高光譜系統裝置構成如圖1所示,系統由六部分組成:ICL-B1620 CCD相機(美國Imperx公司)、ImSpectorV10E成像光譜儀(芬蘭Specim公司)、可變焦鏡頭、3900ER可調諧光源(美國Illumination Technologies公司)、IRCP0076視覺平臺(中國臺灣Isuzu公司)、配有Spectral Image圖像采集軟件的計算機(中國臺灣Isuzu公司)[15]。

菌種培養用PDA培養基,培養基組成為馬鈴薯浸粉5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、氯霉素0.1 g、水1000 mL、pH5.8～pH6.2。每個培養皿含有的培養基體積為20±5 mL,培養基厚度為2.5±0.5 mm。

1.2實驗方法

1.2.1樣本制備將保藏的5種菌種在PDA培養基上28 ℃,75%相對濕度二次活化后,用無菌生理鹽水反復沖洗,制成菌懸浮液,利用血球計數板,將菌懸液稀釋至濃度為4×104cfu/mL待用。

共準備550個培養基,其中空白對照90個,黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、桔青霉四種真菌的平板樣本各90個,構巢曲霉平板樣本100個。

1.2.2高光譜圖像采集采用高光譜圖像檢測系統的反射模式對五種真菌進行檢測,有效波長范圍為400～1000 nm。實驗參數為:相機鏡頭和線光源距離樣本分別為30 cm和20.5 cm,光照強度為30 W,以45°對準樣本,曝光時間為2.5 ms,輸送速度為2.4 mm/sec。

550個樣本同時培養,每種菌及空白在0、8、16、24、36、48、60、84、108 h各拿出10個進行高光譜檢測(構巢曲霉生長較慢,培養時間增加至132 h,即高光譜檢測增加132 h測定時間點)。共獲得550個樣本的高光譜圖像數據。

分別用全黑和全白板獲得高光譜圖像,對樣品高光譜圖像進行校正處理[16]。根據式(1)計算出校正后的相對圖像Rc:

式(1)

式中,R0為原始高光譜透射圖像;D為全黑的標定圖像;W為全白的標定圖像;Rc為標定后高光譜透射圖像。

1.2.3高光譜圖像特征信息的提取利用ENVI(version 4.8,中國Esri公司)軟件,選擇培養基中菌落生長的地方大小約1000個像素點的區域作為感興趣區域(ROI),計算高光譜圖像ROI區域平均光譜值。實驗中提取了所有樣本在波峰709 nm處的光譜響應值(方法Ⅰ)、400～1000 nm波段內光譜值進行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值(方法Ⅱ)[17]作為后續擬合的特征信息。

1.2.4高光譜數據的擬合將每種菌到達最高光譜響應值前的各個檢測時間點的所有樣本進行建模擬合。通過MATLAB(version 7.1,美國Mathworks公司)統計工具箱中Curve Fitting Tool建立五種真菌光譜值隨時間變化的生長曲線,根據擬合模型決定系數(R2)比較模型效果。

1.2.5PLS-DA建立判別模型本文中,偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)被用來建立判別模型[18],區分五種真菌及對照組。其中,70%的樣本用來構建模型,30%用來驗證模型。經過主成分分析(PCA),第一主成分(PC1)及第二主成分(PC2)能代表樣品的主要特征信息,PC1及PC2得分被用來建立PLS-DA模型。

圖1　高光譜圖像系統示意圖Fig.1　The schematic diagram of hyperspectral imaging system

2　結果與分析

2.1五種真菌不同生長階段的高光譜圖像

圖2是高光譜圖像技術采集的不同真菌圖像。可以看出黑曲霉在0～108 h顏色變化最明顯,早期菌落為白色,48 h菌落變黃,后顏色隨時間加深,在108 h平板遍布黑色菌落。構巢曲霉生長最慢,48 h平板才開始出現明顯菌落。米曲霉與雜色曲霉顏色變化相似(早期為白色,后變為黃色),16 h平板出現明顯菌落,48 h平板遍布白色菌落,后白色菌落逐漸變黃,顏色隨時間加深,但雜色曲霉的菌落較米曲霉菌落更為光滑。桔青霉24 h平板出現明顯但少量菌落,后菌落數增加,白色更為明顯,60 h桔青霉呈現灰白色。

圖2　不同菌種的高光譜圖像Fig.2　Typical reflectance hyperspectralimages of different fungi

五種真菌在檢測早期菌絲呈現白色,屬于生長早期,在生長中后期,不同菌種會產生各自的特征顏色。

2.2不同真菌的光譜特征

圖3為不同培養時間的光譜響應值曲線(以雜色曲霉為例)。在400～1000 nm的光譜范圍內,五種菌的光譜值隨時間的延長都是先呈上升趨勢,達到最大光譜響應值后呈現下降趨勢,最大反射光譜值出現在波長為709 nm處的波峰。黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉五種真菌達到最大反射光譜值的時間分別為60、60、60、108、60 h。

圖3　雜色曲霉的平均光譜Fig.3　Average original spectra of Asp. Versicolor

由于真菌生長較慢,黑曲霉、米曲霉,雜色曲霉、桔青霉四種真菌在0～16 h還未在平板上形成明顯菌落,且生長早期菌落呈現白色,故0～16 h光譜變化并不明顯。構巢曲霉較其他四種霉菌的生長更為緩慢,0～36 h內光譜值變化并不明顯,在光譜響應值曲線圖中表現為幾條光譜響應值曲線重合度較大。隨著時間的推移,白色菌絲更明顯,對光的反射也就更大,光譜反射值隨著生長時間的延長而增大,黑曲霉、米曲霉,雜色曲霉、桔青霉四種真菌均在24～60 h有一個較大的升高,并在60 h達到最高的光譜響應值,真菌生長迅速。構巢曲霉在60～108 h有一個較大光譜響應值的升高。此后由于五種真菌的菌絲體產生大量分生孢子,呈現出不同的顏色,且隨時間的推移顏色越深(黑曲霉為黑色,米曲霉、雜色曲霉為黃色,構巢曲霉為灰色,桔青霉為灰白色),光譜響應值隨時間的延長而呈現下降趨勢,其中黑曲霉下降趨勢最為明顯。由此可看出光譜值的變化反映了真菌的生長狀態,與2.1中真菌高光譜圖像反映的結果相一致。

2.3高光譜圖像特征參數對五種真菌的Gompertz擬合

預測微生物學研究者提出了不少用于描述微生物動力學生長的初級模型,主要包括:Gompertz函數、指數函數、線形模型(Linear model)、熱致死D值、修正的Monod 模型、邏輯斯蒂克函數(Logistic function)等。在眾多的初級微生物生長動力學模型中,Gompertz模型[19-25]由于較好的擬合度被廣泛的應用。美國農業部開發的病原菌模型程序PMP(Pathogen Modeling Program)和英國農糧漁部開發的食品微型模型FM(Food Micro-model)都是以Gompertz函數作為初級模型。

利用1.2.4所述的兩種方法處理提取真菌的高光譜圖像特征,將得到的兩種參數(波峰709 nm處光譜值;全波段第一主成分得分值)分別對時間進行Gompertz擬合,對比模型決定系數(R2)如表1所示,結果顯示波峰處數據的擬合效果明顯優于第一主成分得分的擬合效果,分析其原因可能為主成分分析僅去除數據之間的線性相關性,第一主成分得分并不能完全代表真菌生長的特征信息[26]。

表1　兩種高光譜參數的Gompertz生長擬合模型R2比較

注:方法Ⅰ,波峰處(709 nm)的光譜值;方法Ⅱ,400～1000 nm波段內光譜值進行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值。

黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉五種真菌波峰數據擬合曲線如圖4所示,擬合方程分別為:

圖4　709 nm峰值處光譜響應值Gompertz擬合曲線Fig.4　The curves of Gompertz model fitting based on the spectral response value of the wave peak at 709 nm

2.4PLS-DA區分五種菌種

在全波段范圍內,由于光的色散現象導致真菌的光譜值隨菌落的生長而增大,光的色散隨著菌絲的生長而產生,不同菌絲間色散程度會存在差異[27-28],因此通過光學方法可以區分不同菌種。如圖5所示,對不同培養時間的全波段(400～1000 nm)光譜值進行PCA分析,以區分不同菌種和對照組。結果顯示,在生長早期,由于五種菌種生長較慢,主要呈現培養基的透明顏色,較難區分,在0 h(圖5A)、8 h(圖5B)、16 h(圖5C)、24 h(圖5D)、36 h(圖5E)菌種之間存在相互重疊。在培養48 h后五種真菌的光譜響應值出現差異,易于區分。而且五個實驗組在48 h區分最為明顯(圖8F),因此可以利用光譜響應值來區分培養48 h的五種菌及對照組。

圖5　基于不同菌種高光譜全波段響應值的主成分分析Fig.5　Results of PCA for different fungi during the growth注：A:0 h;B:8 h;C:16 h;D:24 h;E:36 h;F:48 h;G:60 h;H:84 h;I:108 h。

根據PCA分析的結果,本文選取培養48 h的菌種加以建模區分,PLS-DA模型區分結果如表1所示。黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉和對照組測試集的區分準確率分別為100%、100%、100%、100%、33.33%、100%。48 h時,雜色曲霉和米曲霉平板均遍布白色菌絲(如圖2所示),此階段菌絲還未呈現各自特征顏色,在光譜響應值中表現為光譜響應值較為相似,易造成誤判,在判定結果中顯示為雜色曲霉測試集區分準確率略低。對照組與五種菌之間的平均區分準確率達88.89%。上述結果表明,高光譜圖像技術能夠區分五種不同真菌。

3　結論

本實驗對稻谷貯藏中5種常見真菌如黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉進行了光譜響應值隨時間變化擬合效果對比,并利用PLS-DA模型加以區分。結果顯示,基于高光譜圖像中可以看出,五種真菌在0～24 h生長緩慢,光譜響應值在此階段無明顯變化。此后進入對數生長期,菌落數量隨時間增加,白色菌絲反射越為明顯,光譜響應值隨時間的延長而增大,五種真菌菌絲體上端分生孢子開始形成(達到最大光譜響應值)并逐漸顯示出各自的顏色,此后光譜響應值隨時間的延長而呈現下降趨勢。

表2　PLS-DA模型區分5種真菌培養48 h的結果

對五種真菌采用Gompertz模型擬合的結果顯示,黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉五種真菌峰值(709 nm)數據的生長擬合模型R2為0.9095～0.9679,而第一主成分得分數據的生長擬合模型R2為0.1781～0.9501,峰值數據的擬合效果明顯優于第一主成分得分的擬合效果,原因可能是在本次實驗中第一主成分的得分不能完全代表菌落生長的特征信息,造成建模效果較差。

利用高光譜反射光譜的全波段信息對五種真菌9個時間點做PCA聚類分析,結果顯示在48 h五種真菌最易于區分,PLS-DA模型對培養48 h的黑曲霉、米曲霉、構巢曲霉、桔青霉四種真菌及對照組的訓練集、測試集的區分準確率為100%;對雜色曲霉訓練集的區分準確率為100%,測試組的區分率為33.33%。此結果表明利用高光譜特征可以實現對該稻谷儲藏中五種真菌的生長擬合和區分,為進一步對稻谷儲藏病害的研究奠定了基礎。

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Growth simulation and discrimination of five fungi from rice storage using hyperspectral reflectance imaging technique

XIAO Hui1,WANG Zhen-jie1,SUN Ye1,GU Xin-zhe1,TU Kang1,DU Li-hui2,PAN Lei-qing1,*

(1.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2.College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance & Economics,Nanjing 210023,China)

Hyperspectral imaging system(HIS)was used in this study to acquire the spectral responses of fungi(Asp.Niger,Asp.Oryzae,Asp.Versicolor,Asp.Nidulans,P.Citrinum)inoculated on potato dextrose agar plates. Two methods for calculating HIS parameters,including the spectral response values of the wave peak at 709 nm,and the scores of the first principal component of the whole spectral range(400～1000 nm)using principal component analysis(PCA),were used to simulate the growth of fungi. The results of Gompertz model revealed that the coefficients of determination(R2)of five fungi based on the score of the first principal component were 0.1781～0.9501,whileR2with 0.9095～0.9679 based on the spectral response value of the wave peak at 709 nm showed better aptitude than the previous method. In addition,fungi species can be discriminated by PCA and partial least squares discrimination analysis(PLSDA)using the spectral information of the full wavelength range. All the classification accuracy of the test group and training group sets by PLSDA models for four fungi(Asp.Niger,Asp.Oryzae,Asp.Nidulans,P.Citrinum)cultured for 48 h were 100%,with the exception of 33.33% for the classification accuracy of training group ofAsp.Versicolor. This paper supplied a new technique and useful information for further study into detecting rice spoilage caused by fungi based on HIS.

hyperspectral imaging;rice;fungi;growth simulation;discrimination

2015-12-04

肖慧(1994-)，女，碩士，研究方向:農產品無損檢測和控制，E-mail:hui.x.1010@outlook.com。

潘磊慶(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：農產品無損檢測，E-mail:pan_leiqing@njau.edu.cn。

糧食公益性行業科研專項經費資助項目(201313002-01)；國家科技支撐項目(2015BAD19B03)；中央高校基本科研業務費專項(KYLH201504)和國家自然科學基金項目(31101282)。

TS255.4

A

1002-0306(2016)13-0276-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.048