具有抑制大腸桿菌作用的乳酸菌的初步篩選及其益生潛能的研究

杜金城,徐　敏,李柏良,丁秀云,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

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具有抑制大腸桿菌作用的乳酸菌的初步篩選及其益生潛能的研究

杜金城,徐敏,李柏良,丁秀云,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

為了篩選出具有抑制致病性大腸桿菌作用的乳酸菌,本實驗以大腸桿菌ATCC25922作為指示菌,抑菌實驗采用牛津杯法。通過發(fā)酵上清液對大腸桿菌ATCC25922的抑菌實驗,初步篩選出三株乳酸菌發(fā)酵上清液對大腸桿菌ATCC25922具有抑制作用,經(jīng)過對16S rRNA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)這三株乳桿菌均為嗜酸乳桿菌。隨后又對這三株嗜酸乳桿菌進行了耐酸、耐膽鹽及抗生素敏感性實驗。結(jié)果表明:KLDS1.0901酸耐受性最強,而KLDS1.0902和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM酸耐受性接近;對照菌株LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力最強,KLDS1.0901和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力差異不顯著,KLDS1.0902膽鹽耐受能力最弱;對于抗生素敏感性,三株嗜酸乳桿菌展現(xiàn)出類似的結(jié)果,對氨基糖苷類的抗生素展現(xiàn)出耐受;相比于KLDS1.0902,KLDS1.0901和KLDS1.1003有著更好的益生作用潛能,因此隨后將對這兩株菌在細胞和動物模型中對抗病原菌的作用進行進一步的研究。

嗜酸乳桿菌,16SrRNA,ATCC25922,牛津杯法,益生作用潛能

腸道疾病主要是由病原微生物引起的,在發(fā)展中國家,有志賀氏桿菌、霍亂弧菌、病原性大腸桿菌及輪狀病毒所造成感染對人的生命造成了嚴(yán)重威脅[1]。世界范圍內(nèi),每年有四百萬的學(xué)齡前兒童死于急性感染的痢疾,并且大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。對于大腸桿菌所造成的感染,傳統(tǒng)方法是服用抗生素進行治療,但抗生素的使用也隨之帶來了一些問題,抗生素在使用過程中會使菌株出現(xiàn)耐藥性,并且病原菌的耐藥性基因存在著水平基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險,再加上服用抗生素一段時間之后常會出現(xiàn)抗生素相關(guān)的痢疾,既二次腹瀉[3]。因此急需替代的解決方法,乳酸菌一些種屬是腸道的固有菌群,加上長期安全使用的歷史,使得乳酸菌來治療大腸桿菌引起的腹瀉就成為了研究的熱點[4],加上乳酸菌可以應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中,擁有巨大的商業(yè)價值潛能,更是促進這一領(lǐng)域的研究發(fā)展。在體外篩選出能抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌就顯得尤為重要。因此本實驗通過體外抑菌實驗,來篩選出能夠抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌,并對篩選出的乳酸菌進行酸耐受性、膽鹽耐受性及抗生素敏感性的實驗,研究其在人和動物體能發(fā)揮對抗病原菌作用的潛能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)。指示菌大腸桿菌ATCC25922和對照菌株LactobacillusacidophilusNCFM來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院姜毓君教授的友情贈送。

鹽酸國產(chǎn)分析純;牛膽粉Biotopped公司;氯化鈉上?；菔郎噭┯邢薰?95%乙醇天津市富宇精細化工有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物英國Oxoid公司;MRS液體培養(yǎng)基；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;DNA提取試劑盒天根生物試劑有限公司;抗生素的藥敏紙片按YY/T1191-2011抗菌劑藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)制備杭州濱和微生物試劑有限公司。

離心機GL-21M上海市離心機研究所;潔凈工作臺VD-1320北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272上海一恒科技有限公司;DYY-10C電泳儀北京六一儀器廠;遠紅外恒溫干燥箱YH-2S天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;快速混勻器XK96-A姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;DU800紫外分光光度計美國Beckman公司。

1.2實驗方法

1.2.1上清液的抑菌實驗

1.2.1.1無細胞上清液的制備將過夜培養(yǎng)的乳酸菌以2%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中,在37 ℃下靜置培養(yǎng)到穩(wěn)定期。離心(8000 r/min,4 ℃,12 min),收集上清液。之后用0.22 μm濾器過濾上清液,以除去菌體及其它雜質(zhì)。無細胞上清液裝入無菌的1.5 mL的離心管中,-4 ℃冰箱中備用。

1.2.1.2抑菌實驗采用牛津杯法[5]測定乳酸菌對大腸桿菌ATCC25922生長繁殖的抑制作用,先在平板內(nèi)加入15 mL含1.5%瓊脂的無菌水,在滅菌臺中靜置60 min,之后在平板上放入牛津杯,接下來調(diào)整大腸桿菌的濃度為1×108CFU/mL,將指示菌菌懸液注入用中試管分裝好的,溫度在50～55 ℃的10 mL滅菌LB培養(yǎng)基中,充分震蕩混勻后,將混合物傾倒于已放有牛津杯的平板中,并在無菌臺中室溫保持60 min待培養(yǎng)基凝固后,無菌條件下將上清液200 μL加入牛津杯中。在4 ℃冰箱中放入2 h后,放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后,記錄培養(yǎng)基上小孔周圍抑菌圈的直徑,作為乳酸菌抑制指示菌生長的指標(biāo)。當(dāng)實驗孔周圍形成2 mm寬清晰可見的抑菌圈時,可認為有抑菌效果。每株菌做3次重復(fù),取平均值。以抑菌圈的大小表示菌株抑制病原菌生長能力的強弱[6]。

1.2.2利用16S rRNA的基因?qū)θ晔人崛闂U菌進行鑒定

1.2.2.1細菌基因組DNA的提取根據(jù)細菌DNA提取試劑盒的說明,進行細菌DNA的提取。

1.2.2.2對16S rRNA的基因進行PCR擴增以三株乳桿菌DNA為模板,利用通用引物27F和1492R對菌株的16S rRNA的基因片段進行擴增,正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,反向引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增體系具體如下:滅菌ddH2O,9.5 μL;2×TaqPCR MasterMix,12.5 μL;基因組DNA,1 μL;上游引物,1 μL;下游引物,1 μL。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃保溫。

1.2.2.3PCR結(jié)果檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2.4對16S rRNA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析將測序獲得的基因序列與GenBank中已知16S rRNA基因序列進行比對,并利用Mega5.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析。其中,系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用Neighbor-Joining法,隨機抽樣1000次[7]。

1.2.3嗜酸乳桿菌的酸耐受性實驗三株嗜酸乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中生長16 h后,進行離心(8000 r/min,4 ℃,12 min)收集菌體,菌體用pH為7.2的磷酸鹽的緩沖溶液重懸兩次。處理后的菌體分別放入裝有pH為2和3的無菌磷酸鹽緩沖溶液的試管中,并調(diào)整菌體的濃度在109CFU/mL。之后將試管放在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,并在0、1、2、3 h分別取樣進行菌落計數(shù),根據(jù)不同時間段嗜酸乳桿菌的菌體濃度與各自0 h的菌體濃度作比較,來評價嗜酸乳桿菌對酸耐受能力的強弱[8]。同時用LactobacillusacidophilusNCFM作為對照。

1.2.4嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性實驗通過以嗜酸乳桿菌NCFM作為對照菌株,將三株對大腸桿菌具有抑菌能力的嗜酸乳桿菌及對照菌株以2%接種量,接種在含有0.3%牛膽粉的MRS的營養(yǎng)肉湯中,同時以不加牛膽粉的MRS的營養(yǎng)肉湯作為對照。將其放在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,每隔一小時測定OD620 nm處的吸光度,連續(xù)測定8 h。分別記錄乳酸菌在含有0.3%牛膽粉和不含有牛膽粉的MRS的營養(yǎng)肉湯中,OD620 nm的吸光度增加0.3個單元所需的時間。膽鹽耐受能力用含有0.3%牛膽粉MRS的營養(yǎng)肉湯中,OD620 nm處的吸光度達到0.3個單元所需的時間,減去不加牛膽粉的MRS的營養(yǎng)肉湯中OD620 nm處的吸光度達到0.3個單元所需的時間來表示,又稱滯后時間[9]。

1.2.5嗜酸乳桿菌的抗生素敏感性實驗抗生素敏感性實驗采用瓊脂片擴散法,對三株嗜酸乳桿菌分別進行青霉素G(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、萬古霉素(30 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)的敏感性實驗。先將含有1.5%瓊脂的MRS固體培養(yǎng)基滅菌,待其溫度降至50～55 ℃時,再將培養(yǎng)16 h以后達到穩(wěn)定期的嗜酸乳桿菌加入MRS固體培養(yǎng)基中,保證嗜酸乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基中的濃度為107CFU/mL,之后向平板倒入20 mL的混合液。放置1 h待其凝固之后,用無菌鑷子將按YY/T1191-2011抗菌劑藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)制備的藥敏紙片貼在MRS固體培養(yǎng)基上,隨后放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,36 h之后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈的直徑,參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]確定菌株對抗生素是敏感、中介或者耐受。

2　結(jié)果與討論

2.1上清液抑菌實驗

利用雙層瓊脂平板打孔法,對乳酸菌的發(fā)酵上清液進行抑菌實驗,其中KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的發(fā)酵上清液對大腸桿菌ATCC25922展現(xiàn)出抑制,抑菌圈的直徑分別為22.1±0.5 mm、20.3±0.4 mm和21.6±0.6 mm。抑菌實驗結(jié)果如圖1～圖3。普遍公認的起抑菌作用的物質(zhì)有有機酸(主要是乳酸和乙酸)、過氧化氫、細菌素和類細菌素物質(zhì)[11],在接下來的實驗會對起抑菌作用的物質(zhì)進行進一步的驗證。

圖1　KLDS1.0901發(fā)酵上清液對ATCC25922的抑菌實驗結(jié)果Fig.1　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.0901 against ATCC25922

圖2　KLDS1.0902發(fā)酵上清液對ATCC25922的抑菌實驗結(jié)果Fig.2　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.0902 against ATCC25922

圖3　KLDS1.1003發(fā)酵上清液對ATCC25922的抑菌實驗結(jié)果Fig.3　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.1003 against ATCC25922

2.2菌株鑒定的結(jié)果

2.2.116S rRNA基因片段的PCR擴增產(chǎn)物由圖4可知,KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的16S rRNA基因片段的PCR產(chǎn)物的條帶清晰,說明該擴增具有特異性,PCR產(chǎn)物片段的大小分別約為1500 bp,與預(yù)期要求的序列大小相符,可以進行純化和測序。

圖4　菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4　Electrophoresis of PCR products of 16S rRNA gene of the strains KLDS1.0901,KLDs1.0902 and KLDS4.1102注:Lane M,Maker DL5000;Lane 1,KLDS1.0901的16S rRNA gene;Lane 2,KLDS1.0902的16S rRNA gene;Lane 3,KLDS1.1003的16S rRNA gene。

2.2.2三株嗜酸乳桿菌16S rRNA基因序列同源性分析16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹如圖,根據(jù)16S rRNA基因序列分析,三株乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.10003均與LactobacillusacidophilusNCFM聚群,并且可信度值為100,由此可以鑒定三株菌均為嗜酸乳桿菌。

圖5　基于16S rRNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.3三株嗜酸乳桿菌的酸耐受性結(jié)果

由圖6所示,當(dāng)受試菌在pH2的PBS緩沖液中孵育1 h后,四株菌的活菌數(shù)都在104以上,表現(xiàn)出較強的酸耐受性。KLDS1.0902和KLDS1.1003展現(xiàn)出與LactobacillusacidophilusNCFM相似的酸耐受性,但KLDS1.0901酸耐受性更強,在pH為2的磷酸鹽緩沖溶液中2 h和3 h分別展現(xiàn)出103和102以上的活菌數(shù)。

圖6　嗜酸乳桿菌對pH2的酸耐受性Fig.6　The tolerance of Lactobacillus acidophilus to pH2

由圖7所示,在pH3時,所有菌株均表現(xiàn)出了良好的酸耐受能力。在pH3的PBS緩沖液中孵育3 h后,所有菌株的存活量仍均超過109CFU/mL,在pH為3的PBS緩沖溶液中展現(xiàn)出相似的酸耐受性結(jié)果。

表1　四株嗜酸乳桿菌對膽鹽耐受能力的結(jié)果

注:每組觀測值都為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列數(shù)據(jù)之間標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

圖7　嗜酸乳桿菌對pH3的酸耐受性Fig.7　The tolerance of Lactobacillus acidophilus to pH3

2.4三株嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性

表1展示了四株嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性結(jié)果,所有菌株都能在含有0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基上生長,展現(xiàn)出良好的膽鹽耐受能力。在滯后時間上KLDS1.0901、KLDS1.1003和LactobacillusacidophilusNCFM差異不顯著,表明三株菌有相似的膽鹽耐受能力.但KLDS1.0902的滯后時間與其它三株菌差異顯著(p<0.05),明顯落后于其它三株菌,表明KLDS1.0902有較弱的膽鹽耐受能力。

2.5三株嗜酸乳桿菌的抗生素敏感性實驗結(jié)果

菌株對抗生素的敏感性被認為是能安全使用的先決條件[12],因此本實驗對三株嗜酸乳桿菌進行抗生素敏感性實驗?？股氐拿舾行詫嶒灲Y(jié)果參照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)[10],分別選取了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和其它等5類10種抗生素,進行抗生素敏感性實驗,結(jié)果如表2。KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003都表現(xiàn)出對氨基糖苷類中慶大霉素和卡那霉素耐受。而對于氨基糖苷類中的鏈霉素,KLDS1.0901和KLDS1.1003表現(xiàn)出耐受,KLDS1.0902表現(xiàn)出敏感。對于其它的七種抗生素,三株嗜酸乳桿菌均表現(xiàn)出敏感。三株嗜酸乳桿菌表現(xiàn)出對氨基糖苷類抗生素耐受這可能和菌體存在天然抗藥性基因有關(guān),Soliman A. H.等人[13]對嗜酸乳桿菌抗生素敏感性測試,結(jié)果也展現(xiàn)出對慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素的耐受。

表2　三株嗜酸乳桿菌對10種抗生素的敏感性實驗結(jié)果

注:其中S表示敏感,I表示中介(表格中沒有此結(jié)果),R表示耐受,數(shù)字代表抑菌圈的直徑,單位是mm。

3　結(jié)論

本文主要對能抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌進行初步篩選,并對益生潛能進行研究。通過以上實驗可得到以下結(jié)論。篩選出三株嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的上清液均能抑制大腸桿菌ATCC25922,抑菌能力KLDS1.0901>KLDS1.1003>KLDS1.0902;通過16S rRNA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,得出三株菌均為嗜酸乳桿菌;對于酸耐受性結(jié)果可以得出KLDS1.0901酸耐受性最強,強于KLDS1.0902、KLDS1.1003和LactobacillusacidophilusNCFM;對于膽鹽耐受性結(jié)果可以得出對照菌株LactobacillusacidophilusNCFM對膽鹽的耐受性最強,KLDS1.0902膽鹽耐受能力最弱。但KLDS1.0901和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力差異不顯著(p>0.05),表現(xiàn)出相似的膽鹽耐受能力;對于抗生素敏感性的結(jié)果表明:KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003對大部分抗生素均表現(xiàn)出敏感,而對一些氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)耐,這是嗜酸乳桿菌普遍存在的現(xiàn)象。以上實驗表明KLDS1.0901和KLDS1.1003有著更強的抑菌作用及益生作用潛能,接下來會在細胞和動物模型中,KLDS1.0901和KLDS1.1003對抗病原菌作用進行進一步的研究。

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Preliminary screening of lactic acid bacteria againstEscherichiacoliand the research of probiotic potential for the screening bacteria

DU Jin-cheng,XU Min,LI Bai-liang,DING Xiu-yun,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select lactic acid bacteria which have the ability to inhibit the growth ofEscherichiacoli,ATCC25922 was used as the indicator bacterium,the culture supernatant from lactic acid bacteria were used to determine if there were antimicrobial activities to the pathogenicEscherichiacoli,using Oxford-cup tests. Three lactic acid bacteria were screened and all of these were determined asLactobacillusacidophilusby phylogenetic analyses of 16S rRNA gene. Subsequently,the tolerance to gastric acidity and bile salts and antibiotic sensitivity of theLactobacillusacidophiluswere further evaluated. The results showed that KLDS1.0901 had the best tolerance to gastric acidity,KLDS1.0902 and KLDS1.1003 had the closer tolerance ability to gastric acidity,comparedLactobacillusacidophilusNCFM. For the tolerance to bile salts,LactobacillusacidophilusNCFM had the best bile tolerance ability and KLDS1.0902 had the weakest ability,there were no considerable differences among KLDS1.0901,KLDS1.1003 andLactobacillusacidophilusNCFM for bile tolerance ability. All of strains showed similar results in the sensitivity to antibiotics,showing tolerance to aminoglycoside antibiotics. Therefore KLDS1.0901 and KLDS1.1003 had the better probiotic potential,compared KLDS1.0902. The antimicrobial effects of KLDS1.0901 and KLDS1.1003 against the pathogenicEscherichiaColishould be further studied in cellular and animal models.

Lactobacillusacidophilus;16S rRNA;ATCC25922;Oxford-cup tests;probiotic potential

2016-01-27

霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

杜金城(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：dujincheng@126.com。

國家863計劃(2012AA022108)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.022