牛磺酸降低高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的作用機(jī)制研究

郭俊霞,張　靜,張　珊,高　亞,陳　文

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

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牛磺酸降低高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的作用機(jī)制研究

郭俊霞,張靜,張珊,高亞,陳文*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

目的:探討牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞膽固醇降解作用及其機(jī)制。方法:以0.02 mmol/L膽固醇加入培養(yǎng)液中建立高膽固醇細(xì)胞模型后,分別加入1、10、20 mmol/L牛磺酸培養(yǎng)48 h,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)、膽固醇酯(EC)及細(xì)胞內(nèi)總膽汁酸(TBAc)和培養(yǎng)液總膽汁酸(TBAm)水平;并檢測(cè)20 mmol/L牛磺酸作用24 h后細(xì)胞CYP7A1及其調(diào)控分子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:10 mmol/L和20 mmol/L牛磺酸作用48 h可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TC、FC和EC(p<0.01),同時(shí)升高了TBAc和TBAm(p<0.05或p<0.01);20 mmol/L牛磺酸作用24 h時(shí)使CYP7A1顯著增加(p<0.05);20 mmol/L牛磺酸作用24 h后MAPK、ERK、JNK、c-jun和p-c-jun表達(dá)明顯降低(p<0.05),而對(duì)HNF4α則無(wú)顯著影響。結(jié)論:牛磺酸可抑制高膽固醇HepG2細(xì)胞MAPK/ERK和MAPK/JNK表達(dá)水平,降低c-jun蛋白表達(dá)及c-jun磷酸化水平,促進(jìn)CYP7A1蛋白表達(dá)升高,從而加速膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。

牛磺酸,膽固醇,膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1),HepG2細(xì)胞

牛磺酸(Taurine)是機(jī)體中一種含硫的非必需氨基酸,自身合成極少,主要通過(guò)膳食攝入,尤其是海產(chǎn)品。近些年來(lái)多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)食源性牛磺酸具有良好的降低膽固醇作用。臨床實(shí)驗(yàn)顯示牛磺酸能有效降低志愿者的血清總膽固醇與動(dòng)脈粥樣指數(shù)[1-2]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,牛磺酸可顯著降低大鼠、小鼠、豚鼠等高膽固醇動(dòng)物模型的血清和肝臟總膽固醇含量,促進(jìn)糞便膽汁酸的排出,并且牛磺酸主要是通過(guò)提高肝臟膽固醇降解限速酶-膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)mRNA或活性水平而起到降膽固醇作用的[1,3-5]。

牛磺酸降膽固醇的體外細(xì)胞研究雖然較少,但其作用于人肝細(xì)胞HepG2、鼠肝細(xì)胞H4IIE和人THP-1源性巨噬細(xì)胞,也均顯著降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[6-7],且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)CYP7A1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)[6-8]。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。但到目前為止,關(guān)于牛磺酸促進(jìn)CYP7A1上調(diào)的分子機(jī)制尚不清晰。

本文以人肝細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象,通過(guò)外源加入膽固醇建立高膽固醇細(xì)胞模型,加入不同濃度牛磺酸,觀察牛磺酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽汁酸的調(diào)節(jié)作用,并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CYP7A1及其調(diào)控分子肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(HNF4α)、MAPK、JNK、ERK、c-Jun、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)的蛋白表達(dá)變化,從而探討牛磺酸調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

HepG2細(xì)胞中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心;膽固醇(純度≥99%)、牛磺酸(純度>99%)、膽固醇氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、膽固醇酯水解酶、水合牛膽酸鈉和4-氨酰安替比林美國(guó)Sigma公司;抗CYP7A1(sc-25536)、抗JNK(sc-571)、抗p-c-jun(sc-7980-R)、抗c-jun(sc-1694)、抗ERK(sc-292838)、抗HNF4α(sc-8987)等一抗、山羊抗兔二抗(sc-2004)美國(guó)Santa Cruz公司;抗MAPK抗體(D1A5)美國(guó)CST(Cell Signaling Technology)公司,抗β-actin一抗美國(guó)Genview公司;BCA試劑盒北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;總膽汁酸測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所。

uQuant Bio-Tek酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Tek公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)通用公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HepG2細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng),以1×105～2×105個(gè)/孔接種于六孔板中。培養(yǎng)液中加入0.02 mmol/L膽固醇孵育24 h細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度升高了33%,因此本實(shí)驗(yàn)以0.02 mmol/L膽固醇建立細(xì)胞高膽固醇模型。根據(jù)處理不同分為:正常對(duì)照組(N),高膽固醇模型對(duì)照組(H),在模型基礎(chǔ)上分別加入1、10、20 mmol/L牛磺酸為牛磺酸組(T),共同培養(yǎng)12、24或48 h。

1.3細(xì)胞內(nèi)膽固醇測(cè)定

細(xì)胞每孔加入1 mL正己烷-異丙醇(2∶1,v/v)慢搖60 min以提取細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì);4 ℃、10000 r/min離心10 min,上清通氮?dú)?0 min除去有機(jī)溶劑;以含10% TritonX-100異丙醇130 mL振蕩溶解上述脂類提取物。按照表1配制總膽固醇(total cholesterol,TC)和游離膽固醇(free cholesterol,FC)測(cè)定工作液。取50 μL脂類提取物,分別加入TC和FC測(cè)定工作液,37 ℃水浴30 min,用酶標(biāo)儀于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[9-10]。

表1　膽固醇測(cè)定工作液配制成分

1.4細(xì)胞膽汁酸測(cè)定

分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液,1% TritonX-100裂解細(xì)胞,以總膽汁酸測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽汁酸(TBAc)和培養(yǎng)液內(nèi)膽汁酸(TBAm)。

1.5細(xì)胞內(nèi)蛋白含量測(cè)定

細(xì)胞提取脂類物質(zhì)后加入裂解液冰上提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,4 ℃、10000 r/min離心10 min,取上清液為測(cè)試樣品。或者測(cè)定TBAc后的裂解液上清為測(cè)試樣品。各測(cè)試樣品以BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

細(xì)胞膽固醇含量以膽固醇與蛋白質(zhì)比值(μg/mg·pro)表示,膽固醇酯(cholesterol ester,EC)=TC-FC;TBAc含量以膽汁酸與蛋白質(zhì)比值表示(μmol/g·pro)表示。

1.6Western Blot法

裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白并以BCA試劑盒定量蛋白濃度。等量取每孔細(xì)胞蛋白30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,在含5%脫脂奶粉封閉1 h,加入不同目的蛋白一抗和內(nèi)參β-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液漂洗3次后加入二抗,室溫孵育2 h。以ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影。條帶結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白及內(nèi)參(β-actin)灰度值分析,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值之比作為所測(cè)目的蛋白相對(duì)含量。

1.7數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

機(jī)體肝臟膽固醇降解為膽汁酸是膽固醇清除的重要途徑,也是體內(nèi)膽固醇平衡的重要環(huán)節(jié)之一。CYP7A1是膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化經(jīng)典途徑的限速酶[11]。綜述近年來(lái)關(guān)于牛磺酸降低膽固醇作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,高脂膳食誘導(dǎo)建立高膽固醇血癥大鼠或小鼠模型,經(jīng)飼料或飲水途徑給予牛磺酸,血清TC降低22%～67%,肝臟膽固醇降低26%～42%,同時(shí)CYP7A1的mRNA增加95%～119%,CYP7A1活性升高82%～151%[1]。

表2　牛磺酸作用48 h對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽汁酸的影響

注:與正常對(duì)照比較,*p<0.05,**p<0.01;與模型對(duì)照比較,#p<0.05,##p<0.01。

本研究以HepG2細(xì)胞外源加入0.02 mmol/L膽固醇建立高膽固醇細(xì)胞模型,在細(xì)胞水平探討牛磺酸調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制。

2.1牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽汁酸的影響

由表2可見,以0.02 mmol/L膽固醇加入HepG2細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)TC、FC和EC均明顯升高(p<0.01),表示高膽固醇細(xì)胞模型建立成功。在此高膽固醇細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,不同濃度牛磺酸作用48 h均使得細(xì)胞內(nèi)膽固醇下降,其中1.0 mmol/L牛磺酸僅使得EC下降,而10 mmol/L牛磺酸使TC和FC分別顯著下降25.3%與24.6%,20 mmol/L牛磺酸則使TC和FC下降幅度達(dá)35.0%與42.8%。從膽汁酸的結(jié)果看出,與模型對(duì)照組相比,1 mmol/L和10 mmol/L牛磺酸均使胞內(nèi)膽汁酸TBAc顯著增多,20 mmol/L牛磺酸卻使TBAc含量有所下降,但培養(yǎng)液TBAm水平則隨著牛磺酸濃度的增加顯著上升,在牛磺酸為20 mmol/L時(shí)達(dá)最大值,表示胞內(nèi)膽汁酸排出到了培養(yǎng)液中。這些結(jié)果顯示牛磺酸促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化,其中20 mmol/L牛磺酸作用最強(qiáng)。

已有的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,Yanagita等在HepG2細(xì)胞加入0.1 mmol/L和1 mmol/L牛磺酸,細(xì)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯水平顯著下降[12],而我們之前的研究也顯示牛磺酸(1～20 mmol/L)作用顯著降低HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、FC和EC[6]。這些牛磺酸對(duì)正常HepG2細(xì)胞的作用與本研究中對(duì)高膽固醇模型的作用不同,可見對(duì)于高膽固醇細(xì)胞需要較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)牛磺酸孵育才能表現(xiàn)出降低膽固醇的效果。

2.2牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞CYP7A1表達(dá)的影響

牛磺酸對(duì)細(xì)胞CYP7A1及其調(diào)控分子的表達(dá)實(shí)驗(yàn)均選取降低膽固醇作用的最佳濃度20 mmol/L。從圖1可知,20 mmol/L牛磺酸分別作用12、24和48 h,與模型對(duì)照組比較CYP7A1表達(dá)量在24 h時(shí)顯著上升(p<0.05)。據(jù)此,后續(xù)調(diào)控CYP7A1表達(dá)的分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)選取20 mmol/L牛磺酸孵育24 h。在正常HepG2細(xì)胞也有對(duì)CYP7A1作用的報(bào)道,牛磺酸(0～20 mmol/L)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)CYP7A1 mRNA和蛋白表達(dá)水平增加,且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性[6,8]。

圖1　牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞CYP7A1表達(dá)的影響 Fig.1　The effect of taurine on the expression of CYP7A1 in high-cholesterol HepG2注:N:正常對(duì)照組;H:高膽固醇模型組;T:牛磺酸組;A:CYP7A1和內(nèi)參蛋白條帶代表圖;B:CYP7A1相對(duì)表達(dá)量柱狀圖;*:p<0.05。

2.3牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)CYP7A1表達(dá)重要分子的影響

體內(nèi)有多條信號(hào)途徑嚴(yán)密調(diào)控CYP7A1的表達(dá)以維持機(jī)體膽固醇膽汁酸的平衡。一方面,膳食膽固醇與肝X受體α(LXRα)結(jié)合活化后可上調(diào)CYP71的表達(dá),促進(jìn)膽汁酸的生成[11,13-14]。另一方面,產(chǎn)生的膽汁酸又可與膽汁酸受體(FXR)結(jié)合活化而抑制CYP7A1的表達(dá)。到目前為止,CYP7A1啟動(dòng)子的invitro研究分析以及HNF4α缺失小鼠的實(shí)驗(yàn)都已證實(shí)肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(HNF4α)是CYP7A1表達(dá)的重要調(diào)控因子,可促進(jìn)CYP7A1轉(zhuǎn)錄表達(dá),增加膽固醇向膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化[15-16]。膽汁酸可以通過(guò)LXR/FXR-依賴與FXR-非依賴兩條負(fù)反饋途徑抑制HNF4α的作用,從而降低CYP7A1的轉(zhuǎn)錄表達(dá),實(shí)現(xiàn)CYP7A1表達(dá)平衡[8,11,17]。本研究重點(diǎn)鎖定牛磺酸對(duì)CYP7A1表達(dá)負(fù)反饋通路FXR-非依賴途徑的影響。在FXR-非依賴途徑中,主要包括MAPK、ERK、JNK、c-Jun等信號(hào)因子。在這條途徑中,產(chǎn)生的膽汁酸會(huì)通過(guò)激活MAPK/JNK、MAPK/ERK途徑,激活和磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun,而磷酸化的c-Jun(p-c-jun)與HNF-4α的結(jié)合可抑制HNF-4α的表達(dá)或活性,直接導(dǎo)致CYP7A1表達(dá)下調(diào)[17-18]。

圖2　牛磺酸對(duì)調(diào)節(jié)高膽固醇肝細(xì)胞內(nèi)CYP7A1表達(dá)的關(guān)鍵分子的影響Fig.2　The effect of taurine on several key moleculars associated with CYP7A1 expressions in high-cholesterol HepG2注:N:正常對(duì)照組;H:高膽固醇模型組;T:牛磺酸組;A、B、C和D:分別為MAPK、ERK、JNK和c-Jun/p-c-Jun蛋白表達(dá)結(jié)果,每組圖中上為目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶代表圖，下為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖;*:p<0.05。

由圖2結(jié)果可知,與正常對(duì)照組相比較,高膽固醇模型組MAPK表達(dá)下降而ERK、JNK、c-jun和p-c-jun表達(dá)無(wú)明顯變化。從圖2A～圖2C可以看出,20 mmol/L牛磺酸作用于高膽固醇HepG2細(xì)胞模型24 h,細(xì)胞內(nèi)MAPK、ERK和JNK表達(dá)比模型細(xì)胞組明顯下降(p<0.05);圖2D結(jié)果表明20 mmol/L牛磺酸使細(xì)胞內(nèi)c-jun和p-c-jun表達(dá)也明顯降低(p<0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明20 mmol/L牛磺酸顯著降低了細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)分子MAPK、ERK、JNK、c-jun和p-c-jun的蛋白表達(dá)水平。

由圖3可以看出,高膽固醇模型與正常對(duì)照組比較細(xì)胞內(nèi)HNF4α表達(dá)無(wú)明顯差異,且20 mmol/L牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞HNF4α也無(wú)明顯影響。

圖3　牛磺酸對(duì)高膽固醇HepG2細(xì)胞HNF4α表達(dá)的影響Fig.3　The effect of taurine on the expression of HNF4α in high-cholesterol HepG2注:N:正常對(duì)照組;H:高膽固醇模型組;T:牛磺酸組;圖中上為HNF4α蛋白和內(nèi)參蛋白條帶代表圖，下為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖。

以上這些結(jié)果提示牛磺酸可能抑制了膽汁酸對(duì)MAPK/ERK、MAPK/JNK通路的激活,使得c-Jun表達(dá)及其磷酸化也受到抑制,導(dǎo)致p-c-Jun的蛋白表達(dá)下降,減少了其與HNF-4α的結(jié)合,最終減弱了產(chǎn)生的膽汁酸對(duì)CYP7A1的反饋性抑制,使CYP7A1蛋白表達(dá)顯著增加。

3　結(jié)論

綜上所述,10 mmol/L和20 mmol/L牛磺酸作用48 h可顯著降低高膽固醇HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平,增加膽汁酸生成;20 mmol/L牛磺酸作用于高膽固醇HepG2細(xì)胞24 h,可抑制MAPK/ERK和MAPK/JNK表達(dá)水平,降低c-jun蛋白表達(dá)及c-jun磷酸化水平,促進(jìn)了CYP7A1蛋白表達(dá)升高,從而加速膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。

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Cholesterol-lowering effect of taurine and its mechanism in high-cholesterol HepG2 cells

GUO Jun-xia,ZHANG Jing,ZHANG Shan,GAO Ya,CHEN Wen*

(College of Applied Arts and Science,Beijing Union University,Beijing 100191,China)

Objective:To study the effect of taurine on cholesterol degradation and its preliminary mechanism. Methods:HepG2 cells were treated with 1,10,and 20 mmol/L taurine for 48 h after being cultured in DMEM supplemented with 0.02 mmol/L cholesterol. Then the levels of intracellular total cholesterol(TC),free cholesterol(FC),ester cholesterol(EC),total bile acids(TBAc)and medium TBA(TBAm)were determined. The expression of CYP7A1 and its regulatory key molecules were detected by western blot after HepG2 cells were incubated with 20 mmol/L taurine for 24 h. Results:TC,FC and EC were significantly reduced and TBAc and TBAm were increased by 10 mmol/L and 20 mmol/L taurine for 48 h-treatment(p<0.05 orp<0.01). The expression of CYP7A1 was significantly increased by 20 mmol/L taurine at 24 h(p<0.05). The expression of MAPK,ERK,JNK,c-jun and p-c-jun were obviously decreased(p<0.05)and the expression of HNF4αhad no significant change by 20 mmol/L taurine for 24 h. Conclusion:Taurine can enhance CYP7A1 expression by inhibiting MAPK/JNK,MAPK/ERK and c-Jun/p-c-Jun expression,to promote the transformation of cholesterol to bile acid in liver cells.

taurine;cholesterol;bile acid;CYP7A1;HepG2 cell

2016-01-20

郭俊霞(1976-)，博士，副教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與功能，E-mail:junxia@buu.edu.cn。

陳文(1966-)，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與功能，E-mail:wlchenwen@buu.edu.cn。

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(5142004)；北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201511417014)；北京聯(lián)合大學(xué)新起點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目(Zk10201404)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)13-0112-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.014