堿蓬黃酮提取物的體外抗氧化及抑菌性研究

趙學思,師仁麗,李　巖,于文龍,王向紅,*

(1.滄州職業技術學院,河北滄州 061000;2.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

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堿蓬黃酮提取物的體外抗氧化及抑菌性研究

趙學思1,師仁麗2,李巖2,于文龍2,王向紅2,*

(1.滄州職業技術學院,河北滄州 061000;2.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

本研究對不同生長時期的鹽地堿蓬中黃酮類化合物進行提取,并對其抗氧化性和抑菌性進行研究。實驗采用超聲波法提取黃酮類化合物,采用4種不同的方法(還原力,抗脂質過氧化能力,DPPH·,·OH)評價堿蓬黃酮提取物的抗氧化活性,采用牛津杯法測定其抑菌活性。結果表明:展葉期,發芽期,花期的黃酮得率分別為0.728%,0.518%,1.461%。不同生長時期的堿蓬黃酮具有不同的還原能力、清除DPPH·和·OH的活性。不同生長時期內的堿蓬總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強的抑制作用,在花期的總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳,抑菌圈直徑分別為19.54 mm和29.46 mm。說明花期的堿蓬總黃酮提取物最適宜作為一種天然的抗氧化劑和抑菌劑而廣泛利用。

堿蓬,黃酮類化合物,抗氧化性,抑菌性

堿蓬為藜科(chenopodiaceae)堿蓬屬(suaedaforsk.)植物,為一年生葉肉質化真鹽生草本植物[1],在5～30 g/kg土壤含鹽量生境中有分布[2]。我國共有堿蓬屬植物20種,常見種分別為堿蓬(Suaedaglauca(Bge.)Bge.)和鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.)Pall),以堿蓬產量最大[3],生于海濱、荒地、田邊等含鹽堿的土壤中,全株富含碳酸鉀,可供工業用。

堿蓬的營養成分豐富,是一種優質的蔬菜和油料作物,保健價值極高[4]。有相關研究報道表明,工業上可用堿蓬籽油來制備共軛亞油酸和硬脂酸,共軛亞油酸由于其具有抗氧化、抗腫瘤、降脂等功效而被廣泛應用于醫藥,同時,堿蓬還能消除裸露鹽堿荒灘,防止水土流失,保持和重建鹽地生態等[3]。

黃酮類化合物是植物產生的一類次生代謝產物,是一類重要的天然化合物,對人體健康起著重要的作用。大量研究表明黃酮類物質具有降血壓、降血脂、增大心臟血流量、增強心臟收縮、減少心臟搏動數、止咳祛痰、抗菌消炎的功效[5]。

堿蓬中黃酮類化合物的研究少見報道。本實驗對在不同生長時期內的堿蓬的黃酮類化合物進行了定性和定量的測定,通過測定其還原力,Fe2+誘發卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化體系中的抗氧化活性,對DPPH·、·OH的清除活性,評價了堿蓬黃酮類化合物的抗氧化活性,并采用抑菌圈和最低抑菌濃度等實驗研究了其抑菌活性。為堿蓬資源的開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌(E.coli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中國微生物菌種保藏中心;堿蓬2014年采于河北滄州地區;蘆丁對照品(≥99%)中國藥品生物制品檢驗;石油醚(60～90 ℃),無水乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉天津市華東試劑廠;鄰二氮菲,三氯乙酸天津市天力化學試劑;硫酸亞鐵,雙氧水北京市中聯化工;鐵氰化鉀天津市福晨化學試劑廠;氯化鐵天津市凱通化學試劑有限公司;DPPH北京索萊寶科技有限公司;硫代巴比妥酸國藥集團化學試劑有限公司。

BS214D型分析天平北京賽多利斯儀器系統有限公司;101-OAB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;萬能粉碎機浙江屹立工貿有限公司;UV-2800H型紫外分光光度計尤尼柯儀器有限公司;XMTD-6000型恒溫水浴鍋北京長風儀表公司;RE-52A型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;QTSX6150型超聲波清洗器天津市瑞普電子儀器公司;TGL16M型離心機長沙易達儀器公司;滅菌鍋上海博迅實業有限公司醫療設備廠;超凈臺蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1原料預處理將收集到的堿蓬,用清水洗凈,置于45 ℃烘箱內烘干,取出后粉碎并過40目篩,備用。

1.2.2堿蓬中黃酮類化合物的提取稱取堿蓬樣品1 g,置于燒杯中,加10 mL石油醚(60～90 ℃),超聲提取30 min,功率200 W,除脂,在水浴下揮干石油醚,加40 mL 70% 甲醇(v/v),浸泡45 min后再超聲提取20 min,重復一次,合并提取液,將提取液離心15 min(4500 r/min)。棄去沉淀得到總黃酮提取液,放于50 mL的容量瓶中,定容。

1.3總黃酮含量的測定

1.3.1對照品溶液的配制精密稱取蘆丁標準品10 mg,溶解在95%的乙醇中,定容至10 mL的容量瓶中,再從中準確量取5 mL,用95%的乙醇稀釋定容至50 mL的容量瓶中,得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.3.2標準曲線的繪制采用NaNO3-Al(NO3)3-NaOH比色法[6],精密吸取蘆丁標準品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,不足5 mL的用95%乙醇補充,加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液,靜置6 min;加入0.5 mL的10%的Al(NO3)3溶液,靜置6 min;最后加入4%的NaOH溶液4 mL,放置10 min。測定其在510 nm處的吸光度值,以標準品濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線。

用以上方法測定樣品的吸光值,通過標準曲線計算得出樣品中總黃酮含量。

1.4還原力的測定

采用孟娜等人的方法[7],取2.0 mL不同濃度的總黃酮溶液,分別加入pH為6.6的0.2 mol/L 磷酸緩沖液2.0 mL及1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL,50 ℃孵育20 min后快速冷卻,加入10%三氯乙酸水溶液2.0 mL,于3000 r/min離心10 min,取上清液5.0 mL,加蒸餾水5.0 mL及0.1%三氯化鐵水溶液1.0 mL,充分混勻后,在室溫下靜置10 min,于波長700 nm處測定吸光度。

1.5Fe2+誘發卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化體系中的抗氧化活性

按照周媛等人的方法[8],稍作修改,配制濃度分別為10,50,100,200,300,400,500 mg/mL的三個時期的堿蓬黃酮溶液,VC溶液為樣品溶液。選用1∶25的卵黃懸液并吸取0.2 mL,加入黃酮溶液0.1,0.2 mL FeSO4溶液和1.5 mL 0.1 mol/L PBS溶液,37 ℃培養15 min。加三氯乙酸(TCA),靜置離心后吸取2.0 mL上清液加入硫代巴比妥酸(TBA),放入沸水浴中15 min,冷卻后,于532 nm處比色測定吸光度值(A),對照管除不加提取液外,其他試劑相同,所測吸光值為A0,樣品及VC和PBS對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率(AOA)根據以下公式計算。

AOA(%)=(A0-A)/A0×100

1.6對DPPH·的清除作用

DPPH·清除率的測定:取2.2所得堿蓬黃酮提取液,真空減壓濃縮,經真空冷凍干燥后得到干燥的堿蓬粗提物。準確稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL取2 mL,加入等體積的0.2 mol/L 的DPPH·溶液,混勻。避光放置30 min,在517 nm測定其吸光度Ai。

清除率(%)=(1-Ai-Aj/Ac)×100

式中,Ai:待測液+DPPH;Ac:無水乙醇+DPPH;Aj:待測液+無水乙醇。

1.7對·OH清除率的測定

根據文獻[10],修改如下:取不同生長時期的堿蓬黃酮提取物,準確稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL,取1 mL依次向樣液中加入2 mL磷酸鹽緩沖液,2 mL鄰二氮菲,2 mL硫酸亞鐵溶液,1 mL 0.1%雙氧水,充分混勻后在532 nm處測其吸光度。

清除率(%)=(A0-A1)/(A2-A1)×100

式中,A1:70%乙醇代替樣液所測的吸光度;A2:用70%乙醇替代H2O2所測的吸光度值。

1.8抑菌性的測定

1.8.1抑菌能力的測定以平板菌落計數法配制濃度約為0.5×107CFU/mL的菌懸液[11]。

準確吸取菌懸液0.1 mL均勻涂布在平皿上,在平板上等距離放入4個經滅菌的牛津杯,分別加入100 μL堿蓬黃酮提取液,用70%的乙醇做對照。28 ℃恒溫培養24 h,用游標卡尺測量抑菌圈直徑,并記錄,各菌重復3次,結果以mm表示。

1.8.2最低抑菌濃度的測定采用2倍稀釋法,將樣品溶液分別稀釋到0.05,0.0125,0.00625,0.003125,0.00156。在每個牛津杯內加入100 μL堿蓬黃酮提取液,用70%的乙醇做對照。28 ℃恒溫培養24 h,用游標卡尺測量抑菌圈直徑不同濃度的稀釋液,28 ℃恒溫培養24 h,觀察菌落情況。在沒有抑菌圈的最高稀釋度提取物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.9數據統計分析

每個實驗操作重復3次,采用spss19.0軟件進行多重比較分析。

2　結果與討論

2.1標準曲線的測定

以1.3.2的方法進行測定,由圖1可得標準曲線的回歸方程Y=13.220x+0.0033,相關系數為R2=0.9999。

圖1　蘆丁溶液的標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2總黃酮含量

圖2顯示了在不同生長時期內堿蓬總黃酮含量的變化。由圖2可知,在不同生長時期,堿蓬的總黃酮含量不同。在整個生長時期內,花期的總黃酮含量遠高于發芽期和展葉期,展葉期的總黃酮含量最低,三個生長時期黃酮含量差異極顯著(p≤0.01)，展葉期、發芽期、花期黃酮得率分別為0.728%、0.518%、1.461%。

圖2　堿蓬總黃酮含量Fig.2　Total flavonoid contents of Suaeda

2.3還原力測定

從圖3可以看出,不同生長時期的堿蓬總黃酮具有一定的還原力,隨著總黃酮質量濃度的增大,其吸光度也增加。還原力強弱順序為展葉期>花期>發芽期。

圖3　不同濃度堿蓬總黃酮的還原力Fig.3　Reducing power of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.4抗脂質過氧化性

由圖4可以看出,所有樣品隨著濃度的降低,對卵黃脂蛋白過氧化的抑制效果減小,濃度范圍在300～500 mg/mL時,花期的總黃酮抑制率大于VC。三個生長時期的堿蓬在Fe2+誘發卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸過氧化體系中的抗氧化活性大小順序為花期>展葉期>發芽期,但是濃度范圍在200 mg/mL時,花期的總黃酮抑制率是最低的。

圖4　不同濃度堿蓬總黃酮對過氧化的抑制率Fig.4　The inhibition rate of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.5對DPPH·的清除作用

從圖5可以看出,不同生長時期的堿蓬總黃酮提取物對DPPH·均具有一定的清除作用,并且在一定范圍內,清除能力隨總黃酮質量濃度的增加而增強逐漸增大,超過這個范圍后,變化不太明顯,甚至有降低的趨勢,表明堿蓬總黃酮提取物對DPPH·的清除能力與質量濃度之間存在一定的劑量效應關系。當堿蓬總黃酮提取物的濃度達到60 μg/mL時,各生長時期內的堿蓬總黃酮幾乎均達到最大的清除率,對DPPH·的清除作用在花期達到最大,為91.43%,而在展葉期最低,為69.87%,發芽期的清除作用最高為89.36%。

表2　堿蓬總黃酮提取物最低抑菌濃度

注：“+”表示有抑菌圈;“-”表示無抑菌圈。

圖5　堿蓬在不同生長時期的總黃酮對DPPH·的清除作用Fig.5　DPPH radical scavenging activity of total flavonoids extract from Suaeda

2.6對·OH的清除作用

從圖6可以看出,在一定范圍內,堿蓬黃酮提取物對·OH的清除率隨黃酮質量濃度的增大而增大。表明堿蓬總黃酮含量與清除作用存在量效關系。當質量濃度為60 μg/mL時,發芽期和花期的堿蓬總黃酮達到最大的清除率,為50.3%和54.46%。而展葉期的堿蓬總黃酮在40 μg/mL時達到最大的清除率,為33.5%。黃酮濃度在10～40 μg/mL范圍時,堿蓬在發芽期的總黃酮提取物對·OH的清除作用要大于其在展葉期和花期的清除作用,而濃度范圍在40～100 mg/mL時,花期的堿蓬總黃酮提取物對·OH的清除作用大于其在展葉期和發芽期的清除作用。

圖6　堿蓬不同生長時期的總黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.6　The ·OH radical scavenging ability of total flavonoids extract from Suaeda

2.7抑菌作用的實驗結果

2.7.1抑菌能力的測定從表1可以看出,不同生長時期的堿蓬總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較明顯的抑制作用,對后者的抑制作用要高于對前者的抑制作用。處在花期的堿蓬總黃酮提取物對大腸桿菌(19.54 mm)和金黃色葡萄球菌(29.46 mm)的抑菌圈直徑要大于其在發芽期(13.10 mm,15.27 mm)和展葉期(14.19 mm,14.53 mm)的抑菌圈直徑。

表1　不同生長時期堿蓬黃酮提取物(1 mg/mL)對供試菌的抑菌效果

2.7.2最低抑菌濃度的確定由表2可知,同一生長時期內堿蓬總黃酮提取物對不同菌的最低抑菌濃度不同,而不同生長時期的堿蓬總黃酮提取物對同一種菌的最低抑菌濃度也不同。發芽期,展葉期和花期的堿蓬總黃酮提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.25、0.25、0.125 mg/mL,對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.125、0.00625 mg/mL。

3　結論

本實驗結果表明在花期的堿蓬總黃酮含量要遠遠大于在發芽期和展葉期,因此,提取堿蓬中的總黃酮的最佳時期為花期。

抗氧化實驗證明,不同生長時期內的堿蓬總黃酮有一定的還原力與抗脂質過氧化性,對DPPH·和·OH均具有一定的清除作用。還原力強弱順序為展葉期>花期>發芽期。三個生長時期的堿蓬在Fe2+誘發卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸過氧化體系中的抗氧化活性大小順序為花期>展葉期>發芽期,但是濃度范圍在200 mg/mL時,花期的總黃酮抑制率是最低的。

不同生長時期內的堿蓬總黃酮對DPPH·的清除效果要大于對·OH的清除效果,這可能是因為不同生長時期的堿蓬所含的黃酮的種類不同。

堿蓬總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用大于對大腸桿菌的抑制作用。

我國堿蓬資源豐富但是利用并不充分。隨著科技的進步和對安全因素的考慮,合成抗氧化劑被天然抗氧化劑取代是必不可擋的趨勢,因此,開發天然的,安全的,成本低廉的抗氧化劑必然成為今后研究的熱點。本研究證明堿蓬是一種具有開發前景的抗氧化劑,同時本實驗對植物提取物的開發和植物資源的綜合利用提供了新的思路和途徑。

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Antioxidation and antibacterial property of flavonoids compounds extracted fromSuaeda

ZHAO Xue-si1,SHI Ren-li2,LI Yan2,YU Wen-long2,WANG Xiang-hong2，*

(1.Vocational and technical college of Cangzhou,061000,China;2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

In this study,the flavonoid compounds in different growth periods ofSuaedasalsawere extracted,and their antioxidant and antimicrobial were studied. Ultrasonic method was used to extract flavonoids. Four methods(reducing power,resisting lipid peroxidation,eliminating DPPH·,·OH)were used to evaluate the antioxidant activity of flavonoids extracted fromSuaedasalsa.The antibacterial activity was evaluated by Oxford cup method. The results demonstrated that the content of the obtained total flavonoids from Leaf expansion,Germination and Florescence was determined to be 0.728%,0.518%,and 1.461%,respectively.Different growth periods of the alkaline flavonoids had different reduction ability,and activity of removing DPPH· and · OH. The flavonoids of Suaeda in different growth period had a certain of bacteriostatic effect toEscherichiacoli,Staphylococcusaureusbut that of in florescence expansion inhibition capability(19.54 mm,29.46 mm)was the strongest. It indicated that the flavonoids extracted fromSuaedacan be used as a natural antioxidant and antibacterial agent extensively.

Suaeda;flavonoids;antioxidation;antibacterial

2015-11-23

趙學思(1972-),男,本科,講師,農產品貯藏與加工方向,E-mail:shp14181514@163.com。

王向紅(1973-),女,博士,教授,食品營養與安全方向,E-mail:wangxianghong73@sina.com。

河北省科技支撐項目(12277117D)；國家海洋公益性行業科研專項(201205031)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.004