酵母菌與乳酸菌發酵對小米淀粉粘度的影響

寇　芳,康麗君,張莉莉,尹　婧,李文杰,王維浩,2,夏天天,寧冬雪,曹龍奎,2,*

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.黑龍江八一農墾大學食品學院 國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319)

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酵母菌與乳酸菌發酵對小米淀粉粘度的影響

寇芳1,康麗君1,張莉莉1,尹婧1,李文杰1,王維浩1,2,夏天天1,寧冬雪1,曹龍奎1,2,*

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.黑龍江八一農墾大學食品學院 國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江大慶 163319)

自然發酵受環境和微生物的影響大,難實現發酵產品的大規模生產。故研究自然發酵優勢菌對小米淀粉的影響很有必要。選取內蒙古赤峰生產的黃金苗小米為原料,利用自然發酵純化的酵母菌與乳酸菌為菌種進行純種發酵96 h,并且與自然發酵后的小米淀粉比較,分析淀粉的粘度、衰減值和回生值的變化。采用0.2 g/100 mL的NaOH溶液提取3 h的方法來提取發酵后小米中的淀粉,并對其發酵液中固形物的含量、pH、淀粉的粘度特性、偏光十字進行測定。結果表明,三種發酵方法所得的發酵液中總固形物的含量都增加;較自然發酵相比,發酵前24 h乳酸菌和酵母菌發酵液中的pH下降迅速,之后變化緩慢;淀粉粘度特性表明,乳酸菌和酵母菌發酵終止時,其粘度的起始溫度、衰減值、回生值較自然發酵相比都下降,峰值粘度較自然發酵相比都上升,乳酸菌發酵和酵母菌發酵的最終粘度與自然發酵相比有所增加,偏光十字顯示無論是自然發酵酵母菌發酵還是乳酸菌發酵,發酵后的淀粉顆粒仍具有偏光十字,說明發酵未改變淀粉的結晶結構。

小米淀粉,自然發酵,酵母菌發酵,乳酸菌發酵,粘度特性

小米中碳水化合物占小米總重的63%～70%,其中淀粉占56%～61%[1],蛋白質含量為9.28%,其蛋白質的消化率為83.4%[2]。市場上用發酵法制得的小米產品不僅可以改善小米制品的成團性,還可以改善小米制品的口感和風味。此外在發酵過程中,還會產生許多小分子物質如單糖、雙糖、游離脂肪酸、乳酸、醋酸等[3]。因此研究自然發酵中優勢菌對小米淀粉粘度的影響具有非常廣闊的發展前景。

自然發酵過程中的微生物主要是為細菌、酵母菌以及少量霉菌等[4]。通過實踐發現,自然發酵過程中微生物的菌群變化,主要以乳酸菌和酵母菌居多,而霉菌主要在發酵液表面,且數量相對酵母菌和乳酸菌少。并且乳酸菌和酵母菌在發酵過程中一直占有絕對優勢,是自然發酵過程中的主要優勢菌種。利用自然發酵過程中篩選并鑒定出的乳酸菌和酵母菌為菌種將小米發酵96 h,通過對比自然發酵與乳酸菌和酵母菌的發酵過程中小米淀粉的粘度特性,來探討自然發酵過程中兩種菌的發酵機理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小米黃金苗小米(內蒙古赤峰小米);氫氧化鈉天津市大茂化學試劑廠;鹽酸廣州萬從化工有限公司;其它試劑皆為國產分析純。

AR2140型分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;S220型pH計瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL16B型臺式離心機上海安亭科學儀器廠制造;DGG-9053A型恒溫箱上海森信實驗儀器有限公司;MJ-10A型磨粉機上海市浦恒信息科技有限公司;RVA4500型快速黏度分析儀瑞典波通儀器公司;RVA專用攪拌槳瑞典波通儀器公司;RVA專用鋁盒瑞典波通儀器公司;NP-80系列透反射偏光顯微鏡寧波永新光學股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發酵小米樣品制備

1.2.1.1菌種制備小米與水的比例為1∶1.2(g/mL)加入蒸餾水,30 ℃下自然發酵96 h后,從發酵液中篩選出優勢微生物菌群,通過分離純化和生理生化鑒定其為乳酸菌和酵母菌,并將優勢菌擴大培養。具體方法為:乳酸菌純化并鑒定后,接種至MRS液體培養基在37 ℃下增殖培養24～48 h,直到乳酸菌菌懸液濃度達到5×108cfu/mL。酵母菌純化鑒定后,接種到YEPD液體培養基上28 ℃下增殖培養24～48 h,直到酵母菌菌懸液濃度達到5×108cfu/mL。

1.2.1.2發酵小米乳酸菌和酵母菌發酵:每種發酵分別取4份小米,每份150 g,用滅菌蒸餾水清洗三遍后置于500 mL燒杯中,加入無菌蒸餾水(小米與無菌水的比例為1∶1.2 g/mL)。吸取擴大培養后的微生物菌懸液(乳酸菌,酵母菌)5 mL接種到小米中,用保鮮膜密封,分別在最適溫度(乳酸菌37 ℃,酵母菌28 ℃)下培養96 h進行發酵。

自然發酵:取小米150 g,按小米與水的比例為1∶1.2(g/mL)加入蒸餾水,30 ℃下自然發酵96 h。

1.2.1.3發酵小米淀粉的制備將發酵完并且過篩后的小米用0.2 g/100 mL的NaOH溶液,料液比1∶3(g/mL),提取3 h,3000 r/min的離心機離心10 min,棄去上清液,剝刮除去沉淀區中上層黃褐色的物質,水洗,連續離心,剝刮,水洗,直至淀粉漿呈白色。用1 mol/L HCl調漿至pH7.0中性,離心,30 ℃干燥,過80目篩,即得淀粉成品。

1.2.2發酵過程中固形物含量的測定每隔24 h分別從上述發酵方式中取出一份發酵樣品,用移液管分別吸取10 mL的發酵液于恒重的坩堝中,105 ℃烘至恒重。

固形物的含量(g/mL)=(m2-m1)/10

式中,m1為坩堝的質量,m2為加入發酵液后烘至恒重的坩堝質量。

1.2.3發酵過程中pH的測定每隔24 h用pH計分別測量每個樣品發酵液的pH。

1.2.4粘度特性的測定利用快速粘度分析儀(RVA)測試小米淀粉糊粘度。稱取樣品3.500 g(干基)于樣品盒中,加水25 mL,35 ℃保溫3 min,以6 ℃/min的速率加熱到95 ℃,保溫5 min,以6 ℃/min的速率降溫到50 ℃。用儀器配套的軟件分析得到曲線。

1.2.5淀粉偏光十字的測定配成1%的淀粉懸液,混勻使淀粉顆粒充分分散,滴1滴于潔凈的載玻片上,置于偏光顯微鏡的載物臺上觀察不同發酵處理的小米淀粉,并拍攝其照片。

1.3數據統計分析

采用excel軟件對數據統計分析。

2　結果與分析

2.1發酵過程中固形物的測定

小米在發酵的過程中,因為浸泡以及微生物菌群產酸產酶的緣故,使得小米中的物質隨發酵時間的延長而溶出,固形物含量的變化反映了小米中物質的溶出情況,不同發酵處理過程中的固形物含量的變化如圖1所示。

圖1　總固形物含量的變化 Fig.1　The variation in content of total solids

根據圖1可知,不同處理小米發酵液中總固形物含量都隨著發酵時間的延長而增加,但酵母菌發酵液固形物的含量隨著發酵時間的延長呈先快速增加后緩慢增加的趨勢。而乳酸菌發酵和自然發酵的總固形物含量在逐步增加。說明發酵可使小米中部分物質分解或溶出,使發酵液中總固形物含量增加。發酵液中總固形物含量的增加一方面由于發酵過程中微生物的代謝產生的酸和酶作用于小米的無定形區,使小米中一些大分子及不溶性的物質被分解成小分子物質,被微生物利用或溶解在發酵液中;另一方面是由于小米在發酵的過程中一直浸泡在發酵液中,使得小米中可溶性的蛋白、脂類及其他成分溶解到發酵液中。所以無論哪種發酵方式,其發酵液中的總固形物的含量都會有所增加。

表1　不同發酵RVA譜特征值

注:Z代表自然發酵,R代表乳酸菌發酵,J代表酵母菌發酵，圖中標有不同字母的回生值表示該發酵類型隨發酵時間的延長其回生值差異顯著(p<0.05)。

2.2發酵過程中pH的測定

不同微生物菌群在發酵過程中,發酵液pH的變化情況如圖2所示。

圖2　發酵過程中pH的測定Fig.2　The determination of pH in the fermentation process

由圖2可知,對于自然發酵來說,其發酵過程中微生物產酸的能力相對較弱。在發酵的前48 h,發酵液的pH下降到4.5以下,之后的發酵過程中pH下降的速度非常緩慢。與自然發酵相比,乳酸菌在發酵的前24 h,發酵液中的pH急劇下降,其pH可達到4.0以下,而發酵24 h以后,其pH的下降的趨勢趨于平緩。說明在發酵的前24 h,乳酸菌迅速增長,代謝活動旺盛,并大量產酸,使得發酵液產生比較柔和的酸味,有效的抑制了雜菌的生長。而酵母菌在發酵的前24 h,其發酵液的pH迅速下降至4.5左右,并且隨著發酵時間的延長,其pH在逐漸降低。但與乳酸菌相比,其pH下降的趨勢要小于乳酸菌。同乳酸菌發酵相比,酵母菌發酵的過程中會產生柔和的酒香。

2.3粘度特性的測定

對比自然發酵,酵母菌發酵和乳酸菌發酵不同發酵時間對小米淀粉粘度特性的影響如表1所示。

用excel軟件對三種不同發酵方式所得小米淀粉的回生值進行相關性分析,可得到回歸方程如下:

y=5.6042x+1888(R2=0.99886)

式(1)

y=-149.8x+2279(R2=0.9955)

式(2)

式(1)代表自然發酵小米粉其回生值隨發酵時間變化的回歸方程,由式(1)可以看出發酵時間對自然發酵回生值的影響呈正相關;式(2)代表乳酸菌發酵隨發酵時間的變化其回生值的回歸方程,由式(2)可以看出發酵時間對乳酸菌發酵回生值的影響呈負相關。

表2　不同發酵第4d的粘度特性

圖3　粘度特性的測定Fig.3　The determination of viscosity characteristics注：1.乳酸菌發酵,2.酵母菌發酵,3.自然發酵。

表1可以看出,發酵時間對自然發酵,乳酸菌發酵和酵母菌發酵小米淀粉的糊化溫度的影響較小,其變異系數分別為0.01%和0.01%,0.01%。自然發酵淀粉的糊化溫度在發酵前48 h先下降后上升,而酵母菌發酵和乳酸菌發酵在發酵的第72 h糊化溫度下降,之后上升。但無論是乳酸菌發酵還是酵母菌發酵,在發酵終止時其糊化溫度都比自然發酵時的糊化溫度要低。其原因可以解釋為發酵使部分蛋白質分解或溶出[5],消除了一些蛋白對淀粉糊化的阻礙作用,因而淀粉顆粒在糊化時更容易吸水膨脹,促進了淀粉的糊化使糊化溫度降低[6];自然發酵的峰值粘度隨發酵時間的延長逐漸降低,而酵母菌和乳酸菌在發酵的前72 h其峰值粘度逐漸下降,之后呈上升趨勢。但無論是乳酸菌發酵還是酵母菌發酵,其發酵前72 h峰值粘度都比自然發酵要低。其峰值黏度的減小可能是因為淀粉無定形區支鏈淀粉的斷鏈與脫支所引起的。峰值黏度的降低是由于發酵后淀粉在熱水中的可溶性更大或發酵過程中產生更短鏈淀粉所引起的;從表1可以看出發酵時間對乳酸菌發酵淀粉的衰減值影響相對較大,而對酵母菌發酵的影響相對較小。自然發酵和酵母菌發酵前72 h的衰減值都呈下降趨勢,而乳酸菌發酵則一直呈下降的趨勢,并且在發酵的過程中酵母菌和乳酸菌發酵的衰減值都比自然發酵過程中的衰減值小;發酵時間對自然發酵和乳酸菌發酵回生值的影響差異顯著,對酵母菌發酵的回生值影響相對于二者較小,但三種發酵方式的變異系數較小。自然發酵的回生值逐漸增大,酵母菌的回生值在發酵的前72 h先減小之后增大,而乳酸菌的回生值則一直減小。發酵所產的酸和酶作用于淀粉顆粒的無定形區,使支鏈淀粉長鏈斷鏈,從而降低了單個支鏈淀粉分子的分支化程度,降低了淀粉再結晶的程度,延緩支鏈淀粉老化傾向。

結合圖3和表2可以看出,乳酸菌發酵,酵母菌發酵第96 h(發酵終止)RVA的變化同自然發酵相比有很大差別,分別體現在:淀粉糊化的起始溫度較自然發酵相比分別下降0.9 ℃和2.85 ℃;峰值粘度較自然發酵相比分別上升185 cP和103 cP。其原因是由于乳酸菌和酵母菌發酵過程中蛋白質明顯減少,使淀粉顆粒在糊化的過程中更易吸水膨脹至更大的體積,故峰值黏度增加。Lim 等研究表明,大米粉中蛋白含量的減少可引起大米粉峰值黏度增加[7]。此外,發酵后大米粉中脂肪含量降低,也可以使峰值黏度增加[8];最終粘度是冷湖在低剪切作用下穩定性的評估。較自然發酵相比乳酸菌發酵和酵母菌發酵的最終粘度變大;衰減值較自然發酵都呈下降的狀態,R4下降978 cP,J4下降400 cP。由于支鏈淀粉的長鏈部分與淀粉糊化的衰減值呈負相關,而短鏈部分與淀粉糊化的衰減值呈正相關[9],長鏈可以提供更強的相互交聯作用來維持膨脹淀粉顆粒的剛性,在加熱攪拌過程中,不易破裂。乳酸菌和酵母菌發酵后支鏈淀粉鏈長變化可能是淀粉衰減值降低的重要原因[10]。衰減值的降低,說明發酵后的小米淀粉在加熱過程中維持顆粒結構完整性的能力增強;回生值反映了糊化后淀粉的穩定性和老化趨勢,RVA 是在十幾分鐘內完成的,故應屬于測定淀粉的短期老化特性。乳酸菌和酵母菌發酵的回生值與自然發酵的相比,回生值均有降低,分別下降743 cP和471 cP。這說明乳酸菌和酵母菌發酵改變了小米淀粉的化學成分而影響其回生特性,使淀粉的短期老化能力都有所下降。

2.4偏光十字

淀粉顆粒內部存在結晶結構和無定形結構,而淀粉分子結晶區具有高度有序的排列,而在非結晶區淀粉分子呈無序的排列,正是這兩種不同的結構在密度和折射率上存在差別,使得淀粉顆粒產生各向異性的現象,當偏振光通過淀粉顆粒時就會產生偏光十字[11]。在偏光顯微鏡下觀察淀粉顆粒呈現黑色的十字,將顆粒分成四個白色的區域,稱為偏光十字或馬耳他十字[12]。

淀粉顆粒通過改性后,其內部的分子鏈有序排列的結晶結構就會遭到破壞,偏光十字就會發生改變或消失,所以淀粉顆粒內部偏光十字的變化在一定程度上可以反映出淀粉顆粒結晶結構是否發生變化。不同發酵時間小米淀粉的偏光十字如圖4所示。

圖4　小米淀粉偏光十字Fig.4　The polarization cross of millet starch注：a：自然發酵,b：酵母菌發酵,c：乳酸菌發酵。

如圖所示三種不同發酵方式所制得的淀粉都有明顯的偏光十字,說明乳酸菌發酵,酵母菌發酵同自然發酵相比,都未使淀粉顆粒的結晶區發生改變。發酵過程中微生物代謝產生的有機酸和酶可能主要作用于淀粉的無定形區,而結晶區幾乎保持不變。

3　結論

自然發酵過程中的主要優勢菌種酵母菌與乳酸菌在發酵時起非常重要的作用。主要體現在四個方面:自然發酵,酵母菌發酵和乳酸菌發酵液中總固形物的含量都增加,但酵母菌發酵和乳酸菌發酵液中的總固形物含量要高于自然發酵過程中的發酵液的總固形物含量。較自然發酵相比,乳酸菌和酵母菌在發酵的前24 h發酵液中的pH下降迅速,24 h以后趨于穩定。發酵終止時乳酸菌和酵母菌發酵小米淀粉的糊化起始溫度、回生值、衰減值較自然發酵下降,峰值粘度、最終粘度上升。回生值的降低有利于改善小米產品的回生特性,耐于儲存。偏光十字表明了無論是哪種發酵方式,發酵后的淀粉顆粒仍具有偏光十字。說明三種發酵方式未使淀粉的結晶結構改變。

由于本文研究主要以乳酸菌群,酵母菌群為主要研究對象,通過對比分析自然發酵來確定其發酵機理,所以對于乳酸菌和酵母菌群中哪種菌對發酵

起主要作用還不是很清楚,所以接下來的工作就是通過確定自然富集的乳酸菌和酵母菌群中何種菌對發酵起實質性的作用進行探討和研究。

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Effect on yeast and lactic acid bacteria fermentation of millet starch viscosity

KOU Fang1,KANG Li-jun1,ZHANG Li-li1,YIN Jing1,LI Wen-jie1,WANG Wei-hao1,XIA Tian-tian1,NING Dong-xue1,CAO Long-kui1,2,*

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.Heilongjiang Farm Produce Processing Development Center,Daqing 163319,China)

Natural fermentation was affected heavily by environment and microbes,it was difficult to achieve the mass production of the fermentation products . Therefore, studying natural fermentation of advantage bacterium to the effect on millet starch was necessary. Selected millet production from Inner Mongolia chifeng Huang Jinmiao as raw material,species by natural fermentation and purification of yeast and lactic acid bacteria were used for pure breed fermentation for 96 h,and compared with natural fermentation of millet starch,the changes of starch viscosity,attenuation and retrogradation value were analyzed. Using 0.2 g/100 mL NaOH solution to extract the methods of extracting 3 h after fermentation of millet starch, and the solids content in the fermented liquid,pH,the starch viscosity property,polarization cross were determined. The results showed that all of the total solids content by three methods of fermentation in the fermented liquid were increased,compared to natural fermentation, the fermentation of lactic acid bacteria and yeast fermentation liquor of pH were declined rapidly before 24 h,then changed slowly. Starch viscosity properties showed that lactic acid bacteria and yeast fermentation termination,the attenuation of the starting temperature,viscosity value,the setback were decreased compared to natural fermentation,the peak viscosity rose more than natural fermentation. Compared with natural fermentation,the final viscosity lactic acid bacteria and yeast fermentation were increased. polarization cross showed both natural fermentation of yeast fermentation and lactic acid bacteria fermentation,starch particles after the fermentation still had the polarization cross,the fermentation did not change the crystalline structure of starch.

Millet starch;natural fermentation;yeast fermentation;fermentation of lactic acid bacteria;viscosity property

2015-12-08

寇芳(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:雜糧發酵，E-mail:18249556388@163.com。

曹龍奎(1965-)，男，博士，研究方向：農產品加工，E-mail：caolongkui2013@163.com。

雜糧專用粉制備及方便面技術集成應用與示范；國家星火計劃項目(2013GA670001)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.003