BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型的建立與評價

王志旺，妥海燕，任遠，李榮科，劉雪楓，程小麗.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型的建立與評價

王志旺1，2，妥海燕1，任遠1，2，李榮科1，劉雪楓1，程小麗1
1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的 建立BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型并進行評價。方法 采用腹腔注射與皮下注射卵清白蛋白（OVA）致敏、霧化吸入OVA激發的方法復制過敏性哮喘BALB/c小鼠模型，激發后期合并灌胃甲狀腺素復制陰虛型過敏性哮喘模型。在監測飲食、飲水及體質量的基礎上，對支氣管激發過程中哮喘行為學、肺功能及肺組織病理學等哮喘相關指標進行觀測，同時對cAMP、cGMP及肺液清除功能等陰虛證相關指標進行考察。結果 陰虛哮喘模型組小鼠出現明顯的哮喘癥狀，哮喘行為學綜合評分明顯升高，吸氣峰流量、呼氣峰流量、潮氣量明顯下降，呼吸頻率增加，肺組織病理學可見明顯的炎癥反應；同時，陰虛哮喘模型組小鼠進食與飲水量明顯增加，而體質量增長緩慢，肺組織濕重/干重比值下降，血清cAMP及cAMP/cGMP升高，cGMP下降，顯示小鼠處于陰虛而陽相對亢盛的狀態。結論 在OVA致敏、激發的基礎上給予甲狀腺素，可成功復制BALB/c小鼠陰虛型過敏性哮喘模型。

陰虛型過敏性哮喘；動物模型；BALB/c小鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.015

近年來，隨著環境污染與過敏體質人群的增加，過敏性哮喘（以下簡稱“哮喘”）的發病率明顯增加［1］；另一方面，隨著社會觀念的變化，偏瘦體質的人（特別是女性）越來越多，導致陰虛質偏頗體質人群迅速增加［2］。本實驗對陰虛型過敏性哮喘模型展開研究，為該動物模型的建立及其評價提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1動物

SPF級雌性BALB/c小鼠48只，6～8周齡，體質量 16～20 g，蘭州獸醫研究所，動物許可證號62000600000082。飼養于甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心，實驗動物實施使用號00000115。

1.2藥物、試劑與儀器

甲狀腺片，山東中泰藥業有限公司，批號14080303。卵清白蛋白（OVA）、氯化乙酰膽堿、組胺，Sigma公司；cAMP、cGMP ELISA測試盒，成都光海科技有限公司；氫氧化鋁，天津市凱信化學工業有限公司。402AI型超聲霧化器，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統，CH Technologies；EMKA型動物肺功能檢測系統，北京廣源達科技發展有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；722型分光光度計，上海第三分析儀器廠；BI-2000型醫學圖像分析系統，成都泰盟科技有限公司。

2 實驗方法

2.1分組、造模與給藥

實驗小鼠按體質量分層隨機分為正常組、陰虛模型組、哮喘模型組和陰虛哮喘模型組，每組12只。自由進食飲水，適應性飼養1周。

實驗第1日開始致敏，即哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠每只腹腔注射配制的新鮮致敏液（OVA 100 μg+氫氧化鋁3 mg生理鹽水混懸液）0.2 mL，同時背部皮下注射等量致敏液，正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替致敏液；第8日同法再致敏1次。第15日開始激發，將小鼠置于暴露系統中，加入激發液（1%OVA），調節霧化速度至2 mL/min，使小鼠均勻吸入激發液20 min，隔日1次，連續28 d，正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替激發液［3-4］。第29日開始，陰虛模型組與陰虛哮喘模型組小鼠給予甲狀腺片藥液120 mg/kg（用0.5%黃原膠助懸）灌胃，正常組與哮喘模型組給予生理鹽水20 mL/kg灌胃，1次/d，連續14 d［5］。

2.2指標觀察

2.2.1一般狀況 觀測動物體質量、呼吸、飲食、飲水等。

2.2.2支氣管激發實驗 實驗第28、42日進行支氣管激發實驗。配制含0.2%組胺與2%乙酰膽堿的混合激發液，在暴露系統中按2 mL/min霧化，小鼠吸入120 s。從霧化吸入開始觀察10 min內小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發作癥狀等哮喘行為學指標并評分：無抓鼻或撓癢動作計0分，抓鼻或撓癢出現1～3次計1分，4～6次計2分，7次及以上計3分；小鼠無哮喘癥狀計0分，出現輕微哮喘癥狀計3分，出現呼吸急促、或呼吸頻率明顯加快或焦躁不安等哮喘癥狀計6分，出現嚴重呼吸困難如急促點頭、腹式呼吸等哮喘癥狀計9分［6］。

2.2.3肺功能檢測 實驗第42日，將小鼠置于肺功能檢測系統中，啟動系統，在時間與事件模式下測定小鼠肺功能。

2.2.4離體指標測定 實驗第43日，麻醉小鼠，摘眼球取血，分離血清，測定cAMP、cGMP水平。斷頸處死，小鼠摘取肺臟，于固定位置取肺組織2份。第1份經固定、切片、HE染色，鏡下觀察肺組織病理學變化，對支氣管壁炎性細胞浸潤程度進行半定量分析［7-8］；第2份準確稱量濕重，充分干燥至衡重后稱取干重，計算濕重/干重比值。

3 統計學方法

4 結果

4.1陰虛哮喘小鼠進食量、飲水量及體質量變化

正常組小鼠實驗過程中飲食飲水無明顯變化，體質量正常增長；與正常組比較，陰虛模型組和陰虛哮喘模型組小鼠第42日進食量、飲水量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），但體質量增長緩慢，顯示出多飲多食、代謝水平升高等陰虛證的癥狀；哮喘模型組小鼠飲水量明顯增加（P＜0.05）；提示陰虛與哮喘均可使飲水量增加，哮喘模型小鼠飲水量增加的原因可能與哮喘咳嗽、咽干口燥而致飲水增加有關。結果見表1、表2。

表1　各組小鼠體質量比較（±s，g）

表1　各組小鼠體質量比較（±s，g）

注：與正常組比較，**P＜0.05

組別 　只數　第1日 　第42日正常組 　12　17.3±1.1 　21.9±1.8陰虛模型組 　12　17.0±1.2 　18.7±1.4**哮喘模型組 　12　17.7±1.3 　19.6±1.6**陰虛哮喘模型組　12　17.1±1.2 　18.5±1.5**

表2　各組小鼠第42日進食量、飲水量比較（±s）

表2　各組小鼠第42日進食量、飲水量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰虛哮喘模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01（下同）

組別 　只數　進食量/g 　飲水量/mL正常組 　12　3.9±0.6 　6.1±0.9陰虛模型組 　12　5.1±0.9**　8.5±1.4**△哮喘模型組 　12　3.5±0.5 　7.1±1.2*△△陰虛哮喘模型組　12　4.6±0.7*　10.1±1.6**

4.2陰虛哮喘小鼠血清cAMP、cGMP及其比值變化

與正常組比較，陰虛模型組、陰虛哮喘模型組小鼠血清cAMP及cAMP/cGMP顯著升高，cGMP明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表3。

表3　各組小鼠血清cAMP、cGMP和cAMP/cGMP比較（±s）

表3　各組小鼠血清cAMP、cGMP和cAMP/cGMP比較（±s）

組別 　只數 cAMP/（pmol/L） cGMP/（pmol/L） cAMP/cGMP正常組 　12 40.57±5.16 　12.20±1.80 　3.39±0.67陰虛模型組 　12 55.85±5.46**10.77±1.19*　5.26±0.91**哮喘模型組 　12 44.70±5.49 　11.76±1.48 　3.87±0.73陰虛哮喘模型組 　12 58.09±6.79**10.32±1.06**5.68±0.86**

4.3陰虛哮喘小鼠支氣管激發實驗哮喘行為學變化

與正常組比較，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組吸入混合激發液后哮喘行為學綜合評分顯著升高，哮喘動物數明顯增加（P＜0.01），而陰虛模型組未出現明顯異常。結果見表4。

表4　各組小鼠支氣管激發實驗哮喘行為學比較（±s）

表4　各組小鼠支氣管激發實驗哮喘行為學比較（±s）

第28日 　　第42日組別 　只數哮喘只數 綜合評分 哮喘只數 綜合評分正常組 　12　 0 　1.8±0.8 　 0 　1.9±0.7陰虛模型組 　12　 1 　1.9±1.0 　 1 　2.1±1.2哮喘模型組 　12　 7**　3.8±1.4**9**　5.4±1.9**陰虛哮喘模型組　12　 8**　4.1±1.7**11**　5.9±2.3**

4.4陰虛哮喘小鼠肺通氣變化

結合動物肺功能儀檢測指標，本實驗對哮喘小鼠吸氣峰流量（PIF）、呼氣峰流量（PEF）、潮氣量（TV）與呼吸頻率（F）等肺功能指標進行檢測。與正常組比較，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠PIF、PEF、TV顯著下降，而F顯著升高（P＜0.01）。結果見表5。

表5　各組小鼠肺通氣指標比較（±s）

表5　各組小鼠肺通氣指標比較（±s）

組別 　只數 　 PIF/（mL/s） 　 PEF/（mL/s） 　TV/μL 　 F/bpm正常組 　12 　 67.10±8.46 　112.94±29.92 　123±22 　117.78±15.24陰虛模型組 　12 　 63.65±8.45 　116.75±31.47 　128±19 　121.25±15.47哮喘模型組 　12 　 46.95±5.65**　 62.98±12.90**　89±12**　168.84±21.78**陰虛哮喘模型組 　12 　 43.83±4.66**　 68.13± 8.90**　91±13**　174.65±24.07**

4.5陰虛哮喘小鼠肺液清除功能變化

本實驗在復制慢性哮喘模型過程中，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠肺組織濕重/干重比值顯著下降，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01），陰虛模型組小鼠肺組織濕重/干重比值有一定的下降趨勢，但與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表6。

表6　各組小鼠肺液清除功能比較（±s）

組別 　只數 　 濕重/干重正常組 　12 　 5.29±0.90陰虛模型組 　12 　 4.83±0.93哮喘模型組 　12 　 4.08±0.76**陰虛哮喘模型組 　12 　 3.82±0.66**

4.6陰虛哮喘小鼠肺組織病理學變化

正常組和陰虛模型組炎癥反應不明顯，哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠肺組織可見支氣管上皮細胞腫脹、部分脫落，基底膜增生、變厚，支氣管壁充血、腫脹并伴有大量炎性細胞浸潤，見圖1。小鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度結果顯示，與正常組比較，哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度明顯加重（P＜0.01），見表7。

圖1　各組小鼠肺組織病理形態（HE染色，×20）

表7　各組小鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度比較

5 討論

中醫陰虛模型的復制方法比較多，但造模簡單可控的當屬甲狀腺素法與糖皮質激素法［9］，而糖皮質激素屬于常用的治療哮喘的藥物，因此，在復制陰虛哮喘模型時，甲狀腺素法是復制陰虛證較適宜的方法。目前，國內外復制哮喘模型最常用的方法為OVA法，即采用OVA通過致敏與激發兩步來復制哮喘動物模型［10］。本實驗基于文獻及前期研究，采用腹腔注射與皮下注射OVA致敏2周、超聲霧化吸入OVA激發4周復制哮喘模型，在此基礎上采用甲狀腺素灌胃復制陰虛哮喘小鼠模型。造模藥物劑量選擇方面，OVA采用最適宜的劑量，復制出典型的哮喘模型；但考慮到動物的承受能力，特別是陰虛哮喘小鼠體質量增長緩慢、死亡率明顯上升等因素，甲狀腺素劑量降為120 mg/kg。

中西醫結合病證模型的評價方面，既要考慮基于病理學對疾病全過程認識的病，又要考慮基于癥候群對疾病現階段認識的證，同時要結合現代研究的最新成果［11］。三大營養物質與水液代謝是生命活動的基礎，陰虛是指機體精血津液（物質）不足與陽（功能）相對亢盛的病理狀態。本研究從小鼠的進食量與飲水量、體質量、肺液清除功能等方面評價陰虛證模型的物質代謝水平，從cAMP、cGMP及其平衡方面評價機體機能虛性亢奮的病理狀態。本實驗結果顯示，陰虛哮喘小鼠進食量、飲水量明顯增加，而體質量增長緩慢，提示模型小鼠基礎代謝率明顯上升，出現“多飲、多食、少肉”的典型陰虛癥狀；血清 cAMP及cAMP/cGMP升高、cGMP下降表明機體處于陰虛而陽相對亢盛的狀態；而肺組織濕重/干重比值下降顯示肺臟處于精血津液不足的虛損狀態。

藥理學評價主要由藥理作用與作用機制2個方面組成，而對動物模型的評價則更應側重于藥理作用，即對病證癥狀的影響。作為哮喘病，痰、咳、喘是臨床最常見的癥狀，也是評價哮喘模型的最基礎指標，但小鼠咳嗽聲音太小而不易察覺，痰液難以量化，唯有哮喘引起的癥狀有明顯特征而易于量化。哮喘可引發呼吸異常，如呼吸急促甚至呼吸伴有點頭、腹式呼吸等，以及缺氧而引發的神經系統癥狀如焦躁不安、直立靜坐或急促爬刨墊料等異常行為。采用OVA復制的哮喘屬于過敏性哮喘，動物會出現鼻腔與皮膚發癢。因此，抓鼻、撓癢也屬于易量化的指標。本研究對小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發作癥狀等哮喘行為學指標進行評價，結果顯示陰虛哮喘模型小鼠哮喘等行為學指標評分出現明顯的變化。肺功能與肺組織病理學是反映肺臟功能與結構的最直接指標，本研究對肺功能指標PIF、PEF、TV與F進行考察，結果提示陰虛哮喘小鼠的肺功能明顯下降；病理結果顯示，陰虛哮喘小鼠肺組織出現一定的病理學變化，而支氣管壁炎性細胞浸潤程度明顯加重。

綜上，在OVA復制哮喘模型的基礎上，采用甲狀腺素復制陰虛哮喘BALB/c小鼠模型，該造模方法簡便、觀測指標變化明顯且符合西醫對病的診斷和中醫對證候的認識特點，為研究陰虛哮喘的本質及平喘藥物的作用機制提供了較為理想的動物模型。

［1］陳小聰，吳紅娟，李錦燕.溫州兒童哮喘發作與空氣污染及氣象因子的相關性分析［J］.中國兒童保健雜志，2015，23（1）：11-14.

［2］梁永林，高彩霞，李乾琦，等.應用中醫體質量表對703名大學生體質分型的研究［J］.時珍國醫國藥，2014，25（1）：162-163.

［3］杜軍，郭宏偉，鄧家剛.哮喘小鼠模型研究現狀分析［J］.中國免疫學雜志，2011，27（1）：1209-1211.

［4］BOSNJAK B， TILP C， TOMSIC C， et al. Tiotropium bromide inhibits relapsing allergic asthma in BALB/c mice ［J］. Pulm Pharmacol Ther，2014，27（1）：44-51.

［5］賀玉偉，柴程芝，寇俊萍，等.甲狀腺素誘導小鼠模型表觀指征變化與陰虛火旺證的相關性研究［J］.實驗動物科學，2013，30（2）：1-6，10.

［6］王志旺，孫少伯，王永輝，等.當歸揮發油對哮喘大鼠的平喘作用及其對IL-4、IFN-γ的影響［J］.免疫學雜志，2013，29（5）：391-394.

［7］劉仁慧，王秀娟，許利平，等.培本方對哮喘模型大鼠的藥效學研究［J］.中成藥，2010，32（5）：741-746.

［8］王力寧，李志峰，陳平蘭，等.六味地黃顆粒對哮喘大鼠血清 NO及肺組織NOS水平影響的研究［J］.廣西中醫藥，2011，34（1）：47-52.

［9］王萍，王喜軍.腎陰虛證動物模型研究概況［J］.中醫藥信息，2013，30（4）：123-125.

［10］馬子風，尹磊淼，冉君，等.小鼠過敏性哮喘模型制備的特點分析［J］.東南大學學報（醫學版），2014，33（5）：650-655.

［11］袁福寧，陳四清，李曉冰，等.制備體質-病-證三位一體動物模型的構想［J］.中華中醫藥雜志，2012，27（7）：1735-1737.

（修回日期：2015-11-06；編輯：華強）

Establishment and Evaluation of BALB/c Mouse Model of Anaphylactic Asthma with Yin-deficiency Syndrome

WANG Zhi-wang1，2， TUO Hai-yan1， REN Yuan1，2， LI Rong-ke1， LIU Xue-feng1，CHENG Xiao-li1（1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Objective To establish and evaluate a BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome. Methods Ovalbumin （OVA） was injected to sensitize and was inhaled to stimulate to replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma. Thyroxin was used for gavage during late stimulation to replicate the BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome. On the basis of monitoring food and water intake and body weight， asthma related indexes， such as asthmatic behaviors， respiratory function， lung histopathology， were detected， and yin-deficiency syndrome related indexes， such as cAMP and cGMP， and pulmonary fluid clearance were examined. Results The BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome showed obvious asthma symptoms； comprehensive scores of asthmatic behaviors increased significantly；inhaling peak flow， exsufflation peak flow， and tidal volume decreased significantly； lung tissue histopathology showed obvious inflammatory response. Meanwhile， food and water intake of BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome increased significantly； body weight increased slowly； wet/dry ratio of lung tissue decreased；cAMP and cAMP/cGMP increased， while cGMP decreased， which showed that the mice were in the condition of yin-deficiency and yang-excess. Conclusion Combining thyroxin at the basis of sensitivity induced by OVA is a good pattern to successfully replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome.

anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome； animal model； BALB/c mice

R228；R259.622.5；R332

A

1005-5304（2016）09-0061-04

國家自然科學基金（81460668）；甘肅省自然科學基金（1310RJZA086）

2015-10-02）