培養基配方對冬蟲夏草菌株產生粉紅異變的影響研究

張宗豪，李玉玲（青海大學畜牧獸醫科學院，西寧810016）

培養基配方對冬蟲夏草菌株產生粉紅異變的影響研究

張宗豪，李玉玲*
（青海大學畜牧獸醫科學院，西寧810016）

冬蟲夏草真菌篩選過程中，蝙蝠蛾擬青霉SH-1的菌絲會逐漸產生粉紅色變化，SH-1和粉紅菌株ZH-1在形態上存在很大差異，經分子鑒定，兩株菌為同一種。為查明產生粉紅菌株的原因，最大化粉紅菌株的得率，在考察4個培養基配方因素對粉紅菌株產生的的單因素試驗基礎上，通過響應面法中的BBD設計優化冬蟲夏草培養基配方，分析影響菌株SH-1產生粉色變化的因素。結果表明：產生ZH-1最適的培養基配方為氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培養基配方條件下，菌株ZH-1產生概率為37.24%。試驗結果表明，培養基配方中氮源A、K2HPO4的含量對產生粉紅現象有顯著影響，氮源A、葡萄糖含量對粉紅菌株ZH-1的得率有顯著影響。

響應面法；冬蟲夏草菌株；培養基配方；粉紅變化；產生概率；得率

冬蟲夏草［Cordycepssinensis（BerK.）Sacc.］屬真菌界（Fungi）子囊菌綱（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲夏草屬（Cordyceps）的冬蟲夏草菌（Cordycepssinenss）寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體［1］，《中華人民共和國藥典》對其功用的描述是：“補肺益腎，止血化痰。用于久咳虛喘，陽痿遺精，腰膝酸痛”。冬蟲夏草主要分布在我國青海、西藏、四川、甘肅等海拔3 000—5 000 m的部分地區，冬蟲夏草是主產區群眾經濟財源的重要組成部分［2］。近年來冬蟲夏草采挖嚴重過度，使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭，野生冬蟲夏草生產面積正在逐年縮小，產量也隨之下降［3］。

冬蟲夏草人工培育的菌絲體成份、含量與天然冬蟲夏草非常相似，是天然冬蟲夏草最適替代品［4］。在本實驗室靜止培育冬蟲夏草菌株SH-1的過程中，發現部分培養瓶內菌絲體生長到一定時期，從中間開始轉化成粉紅色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面變成有張力、有韌性的光滑表面，富含水分，周圍又形成多層毛刺狀結構。隨著生長瓶內培養物逐漸形成一個整體，周圍與瓶壁緊密結合，培養物顏色鮮艷，整體呈果凍狀。將產生變化后的粉紅色菌株編號為ZH-1。

圖1　菌株SH-1和粉紅菌株　ZH-1Fig.1　Comparison ofstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1

菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1的ITS序列比對鑒定中發現，11株SH-1和2株ZH-1都能擴增出條帶，條帶清晰且穩定，13株菌株在Genbank中應用Blast比對，與Paecilomycessp.Cs-4（EU328187）的相似性達到了100%，用三種方法（鄰位相連法、最大可能性法、最大簡約性法）對13株菌株ITS序列與分離自冬蟲夏草的32株真菌ITS序列（下載自Genbank）構建系統進化樹，三種方法都顯示13株菌與蝙蝠蛾擬青霉分為一支，可以確定粉紅菌ZH-1與正常菌株SH-1為同一個種，即蝙蝠蛾擬青霉。

粉紅色變化影響到了SH-1的正常生長，為了查明產生的原因，本試驗針對培養過程中與菌株生長有直接關系的培養基配方進行研究，利用響應面法尋找配方組合對粉紅菌株產生的影響。Box-Behnken設計結合響應面法是通過采用多元線性擬合或二項式回歸分析來表達因素與響應值之間函數關系的一種統計方法［5］，且可以明確任意兩個因素的交互作用影響，結果直觀、可靠，且試驗效果好。

本研究在單因素試驗的基礎上選擇氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4個主要因素（為了保密培養基配方，兩種氮源標記為：氮源A與氮源B），考察了4個因素對粉紅菌株ZH-1產生概率和得率和SH-1得率的影響，對影響粉紅菌株產生概率和得率的配方因素進行了優化，以期找出適合粉紅菌株生長的最適配方條件，為下一步闡明兩個菌株之間的關系和初步探討產生的機理提供數據支持和理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌種：冬蟲夏草菌由青海省畜牧獸醫科學院純化培養，編號為SH-1，經中科院微生物研究所鑒定為蝙蝠蛾擬青霉，保存于本研究室。

主要儀器：組培瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、多功能光照培養箱、FA1004電子分析天平。

分離用固體培養基（改良PDA培養基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15—20g，自來水1 000 mL，自然pH，添加3g牛肉膏。

培養用液體培養基：每200 mL溶液中，土豆20g、胡蘿卜10g、氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、MgSO40.1g、K2HPO40.4g。

1.2試驗方法

1.2.1培養條件

冬蟲夏草菌液體培養條件設定為：500 mL的培養瓶中，培養液200 mL、接種量為10 mL、pH 5.8，培養溫度為20℃，光照條件為自然光照，培養時間為60d。單因素試驗每個處理134瓶，重復3次。響應面試驗每個處理20瓶，重復3次。

1.2.2菌絲體生物量的測定

每個處理菌絲體在生長到60d以后，收集已長成菌塊的菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，60℃條件下干燥至恒重，測定即為菌絲體干重。

1.2.3產生概率和得率的計算

式中：M為收取的菌絲體干重（g），V為平均裝液量（mL）。

1.2.4單因素和響應面法試驗設計

由單因素試驗考察氮源A、氮源B、K2HPO4、葡萄糖對粉紅菌株產生的影響，再通過4因素3水平的響應面試驗結果，確定產生粉紅菌株的最適配方條件以及影響SH-1與ZH-1得率的最適配方條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1　試驗因素與水平設計表Table 1　Liner equations and factors of four formula components

1.2.5數據處理

利用EXCEL 2007軟件進行數據整理，SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，Design-expert 8.0軟件進行響應面法分析。

2　結果與分析

2.1冬蟲夏草菌培養基配方單因素試驗

2.1.1氮源A對產生粉紅菌株的影響

固定氮源B 5g、葡萄糖8g、K2HPO40.5g，選擇氮源A含量分別為20 mL、40 mL、60 mL、80 mL進行試驗，結果見圖2、圖3。

圖2　不同氮源A含量對SH-1產生　ZH-1變化概率的影響Fig.2　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖3　不同氮源A含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.3　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由圖2可知，在氮源A含量為40 mL時SH-1產生ZH-1的變化概率最大，圖3顯示，隨著氮源A含量的增加，ZH-1的得率也在增加，在60 mL時的得率與20 mL、40 mL時有顯著差異，與80 mL沒有顯著差異。SH-1的得率也隨著氮源A含量的增加而增加，并且每個梯度都有顯著差異，因此，綜合考慮到粉紅色變化概率和ZH-1的得率，選擇氮源A含量為40 mL為宜。

2.1.2K2HPO4對粉紅菌株產生的影響

固定氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、，選擇K2HPO4含量分別為0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g進行試驗，結果見圖4和圖5。

圖4　不同　K2HPO4含量對SH-1產生　ZH-1變化概率的影響Fig.3　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖　5 不同　K2HPO4含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.4　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由圖4可知，在K2HPO4含量為0.4g時SH-1產生ZH-1的變化概率最大，圖5顯示，隨著K2HPO4含量的增加，ZH-1的得率先增加后減小，得率差異不顯著。SH-1的得率隨著K2HPO4含量的增加有所增加，得率差異也不顯著，因此，選擇K2HPO4含量為0.4g為宜。

2.1.3氮源B對粉紅菌株產生的影響

固定氮源A 40 mL、K2HPO40.4g、葡萄糖8g、，選擇氮源B含量分別為1g、2g、3g、4g、5g進行試驗，結果見圖6、圖7。

圖6　不同氮源B含量對SH-1產生ZH-1變化概率的影響Fig.6　Effects ofdifferent nitrogensource B content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖7　不同氮源B含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.7　Effects ofdifferent nitrogen source B content on fungi yield of SH-1 and ZH-1

由圖6可知，在氮源B含量為2g時SH-1產生ZH-1的變化概率最大，圖7顯示，隨著氮源B含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也隨之增加，并且每個梯度都有顯著差異，因此，選擇氮源B含量為2g為宜。

2.1.4葡萄糖對粉紅菌株產生的影響

固定氮源A 40 mL、K2HPO4含量0.4g、氮源B 5g，選擇葡萄糖含量分別為2g、4g、6g、8g、10g進行試驗，結果見圖8、圖9。

由圖8可知，在葡萄糖含量為4g時SH-1產生ZH-1的變化概率最大，圖9顯示，隨著葡萄糖含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也先增后減，ZH-1在葡萄糖含量為6g時出現最大值，與其他梯度相比，差異顯著，而SH-1在葡萄糖含量為8g時出現最大值。因此，選擇葡萄糖含量為6g為宜。

2.2響應面法試驗結果

通過上述的單因素分析，我們篩選出了氮源A（x1）、K2HPO4（x2）、氮源B（x）、葡萄糖（x4）4個主要因素，采用Box-Behnken設計結合響應面法，以菌株SH-1變化為菌株ZH-1概率和ZH-1的得率為響應值，考察影響產生粉紅菌株的培養基配方因素，試驗結果見表2。

圖8　不同葡萄糖含量對SH-1產生　ZH-1變化概率的影響Fig.8　Effects ofdifferentglucose content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖9　不同葡萄糖含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.9　Effects ofdifferentglucose content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

表2　試驗設計與結果（n=4）Table 2　Optimization of extraction condition and Results of experiment（n=4）

表3　配方條件對粉紅菌株ZH-1產生概率與得率模型方差分析結果Table 3　The model variance analysis results of change probability and fungi yield ofstrain ZH-1

根據表3中回歸模型的方差分析可知，模型1的F=66.99，P＜0.0001，模型2的F=222.52，P＜0.0001，說明本試驗所選用的二次多項式模型具有高度的顯著性。模型1的F失擬=0.291667，失擬項P= 0.9481＞0.05，模型2的F失擬=0.36095，失擬項P=0.9129＞0.05，失擬項均不顯著，兩個模型的決定系數R2值分別為0.9857和0.9955，說明兩個模型能夠解釋98.57%和99.55%的響應值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預測菌株ZH-1的產生概率和得率。在總的作用因素中，回歸方程一次項x1、x2、二次項和交互項對菌株ZH-1的產生概率均有較高的顯著性，由F值的大小可以推斷2個因素影響y1的排序為：x1＞x2；回歸方程一次性x1、x4、二次項和交互項x1x3對菌株ZH-1的得率均有較高的顯著性，由F值的大小可以推斷2個因素影響菌株y2的排序為：x1＞x4。

試驗所選用的四個因素，不僅影響到菌株SH-1產生菌株ZH-1的概率，而且對粉紅菌株ZH-1得率有影響。分別以y1、y2為響應值，以x1、x2、x、x4為因變量，通過擬合可求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯方程，多元回歸擬合分析如下。

產生粉紅菌株ZH-1概率的二次方程模型為：

產生粉紅菌株ZH-1得率的二次方程模型為：

2.3因素間的交互影響

根據擬合模型繪制菌株ZH-1產生概率及得率響應面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應面的最高點，即參數范圍內的極值以及因素間的相互作用對響應值的影響，依次可以確定最適培養基配方條件范圍，Design-expert 8.0軟件處理后三維響應面和等高線圖（圖10、圖11）。

圖10　菌株　ZH-1的產生概率模型的等高線及響應面圖Fig.10　The model’s contour and responsesurface plot of change probability ofstrain ZH-1

圖11　菌株　ZH-1的得率模型的等高線及響應面圖Fig.11　The model’s contour and responsesurface plot of fungi yield ofstrain ZH-1

分析圖10可知，氮源A（x1）、K2HPO4（x2）對菌株ZH-1產生概率的影響顯著，表現為曲線較陡，即隨著氮源A和K2HPO4的增加或減少，響應值變化較大，其他項影響較小，表現為曲線較為平滑，即隨其他項的增加或減少，響應值變化較小。交互項中氮源A（x1）與氮源B（x3）、氮源A（x1）與葡萄糖（x4）、K2HPO4（x2）與氮源B（x3）、氮K2HPO4（x2）與葡萄糖（x4）的等高線圖呈橢圓形，表明這些因素的交互作用對菌株ZH-1產生概率有顯著影響。分析圖11可知，氮源A（x1）、葡萄糖（x4）對菌株ZH-1的得率有顯著的影響，其他項影響較小。交互項中氮源A（x1）與氮源B（x3）的交互作用對菌株ZH-1的得率有顯著的影響，其他項有一定的交互作用，但作用不顯著。

2.4菌株ZH-1產生概率及得率最適的配方條件

根據軟件Design-expert 8.0對試驗對試驗結果進行最優化分析，得出了菌株ZH-1產生概率的最適配方條件為：氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培養基配方條件下，菌株ZH-1產生概率為37.24%；通過方程，得出了ZH-1的最大得率配方條件為氮源A（x1）60 mL，K2HPO4（x2）0.4g、氮源B（x3）2.11g、葡萄糖（x4）6.22g。菌株ZH-1得率可達到7.14%。

3　結論

本研究以SH-1轉變為ZH-1的概率和ZH-1的得率為量化指標，從氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4個因素的進行了單因素試驗，在此基礎上通過響應面法試驗分析，建立了4個因素與產生菌株ZH-1概率、得率的數學模型，用響應面法確定培養基配方影響菌株SH-1產生菌株ZH-1的因素。試驗表明，模型的回歸效果顯著，氮源A、K2HPO4可以作為預測菌株SH-1轉變為菌株ZH-1的培養基配方因素。試驗確定了產生粉紅菌株ZH-1最適的培養基配方，為進一步確定菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1之間的關系提供數據參考，對粉紅菌株的培養有一定的實際應用前景。

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（責任編輯：張睿）

Effects of medium formula on Cordycepssinensis fungistrain emerging pink variation

ZHANG Zong-hao，LI Yu-ling*
（Animal and Veterinarysciences Academy of Qinghai University，Xining 810016，China）

A portion of fungistrainsH-1 wouldgradually change to pink colorduring thescreening process of Cordycepssinensis fungi.Although there was big morphologicaldifference betweenstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1，molecular identificationshowed that the twostrains were thesamespecies.Forseeking the reason of emerging pink variation and obtaining the maximum yield of the pink fungi，four main factors including nitrogen A，K2HPO4，nitrogen B andglucose wereselected on the basis of experimental results ofsingle factors through responsesurface methodology.The optimum culture conditions were as follow：43.51 mL nitrogen A，0.6g K2HPO4，2.56g nitrogen B，5.18gglucose.Under the conditions，the optimum change probability of ZH-1 was 37.24%.The resultsshowed that the medium formula nitrogen A and K2HPO4had very important effects on ZH-1 appearing probability，nitrogen A andglucose had very important effect on ZH-1 yield.

Responsesurface method；Cordycepssinensis fungistrain；Medium formula；Change probability；Yield

S567.35

A

1000-3924（2016）04-035-07

2015-06-01

青海省科技廳國際合作項目“利用分子生物學開支青海冬蟲夏草原產地保護質量評定研究”（2014-HZ-809）

張宗豪（1982—），男，碩士，助理研究員，主要從事草地微生物研究。E-mail：13897454181@163.com，Tel：13897454181

李玉玲（1969—），女，研究員，主要從事冬蟲夏草研究。E-mail：Yulingli2000@163.com，Tel：0971-8562517